10月4日，斯坦福Nathanael S. Gray教授和Gerald R. Crabtree教授在science上共同发表了一篇题为“Relocalizing transcriptional kinases to activate apoptosis”的文章。作者使用一种二价分子，将蛋白激酶CDK9的抑制剂与BCL6的配体连接起来，由此产生的双价分子将CDK9及其活性重新定向到BCL6调控的位点，从而激活细胞死亡。使用化学诱导的接近将激酶抑制剂转化为治疗基因的激活剂。![]()
图1 将激酶抑制剂转变为治疗基因的激活剂
调节转录的细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）是癌症治疗中的有希望的治疗靶点。已经研究了使用选择性小分子抑制剂和靶向蛋白质降解剂对转录CDKs进行药理干扰的方法。这些分子模仿了CDK功能遗传丧失的表型，并面临基于机制的毒性，因为转录CDKs对健康细胞至关重要。作者没有试图抑制或降解CDKs，而是开发了一种药理策略，该策略利用化学诱导的邻近性将转录激酶转化为癌症特异性的细胞死亡基因激活剂。文章中作者开发了一种双价分子，将转录激酶的活性集中在B细胞淋巴瘤6（BCL6）转录因子上，其过度表达通过调节细胞死亡和增殖来推动弥漫大B细胞淋巴瘤的发展。其工作的中心是一个化合物库，这些化合物将结构多样的、与ATP竞争的CDK9抑制剂（CDK9是正转录延伸因子b（P-TEFb）复合体的一个亚基）与 BCL6 广泛复合物、tramtrack 和 bric-à-brac（BTB） 结构域的结合物连接起来。这些分子称为CDK转录/表观遗传化学邻近诱导剂（CDK-TCIPs）。作者同时设计了一系列检测方法来识别能够（i）激活BCL6调控的转录，（ii）与CDK9和BCL6形成三元复合物，以及（iii）杀死BCL6过度表达的淋巴瘤细胞的化合物。最有效的CDK-TCIPs在亚纳摩尔浓度下杀死弥漫大B细胞淋巴瘤细胞的能力比单独抑制CDK9和BCL6的小分子的联合效应强100倍。此外，这些分子对正常人类淋巴细胞的毒性比对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞的毒性低200倍。蛋白质组学、表观基因组学和转录组学研究表明，CDK-TCIPs将细胞内部分CDK9重新定位到BCL6结合的DNA上，覆盖了BCL6通常执行的表观遗传沉默。在BCL6结合的位点，这些分子导致RNA聚合酶II的延伸和促凋亡的、BCL6靶向基因的激活，导致细胞死亡。最有效的分子专门对859种不同癌症细胞系中过度表达BCL6的淋巴瘤细胞具有细胞毒性。作者首先测试了化学诱导的接近是否可用于将激酶抑制剂转化为表观遗传沉默转录状态的激活剂。其专注于被锌指转录因子 BCL6沉默的基因转录，该基因在40%至60% 的人弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）病例中失调和过表达，从而驱动这种癌症的进展。在生发中心（GC）B细胞发育过程中，BCL6通常会沉默肿瘤抑制基因和程序性细胞死亡（凋亡）基因的转录，包括 PMAIP1、TP53和CDKN1B或p27。BCL6通过抑制DNA 损伤反应和细胞死亡途径在DLBCL中充当癌基因。它通过调节区域的染色体易位和突变直接失调，或通过拮抗因子的失活突变间接失调。BCL6的多种高亲和力抑制剂BTB系列和BCL6降解剂已开发出来，但对肿瘤抗增殖的影响很小。作者此前曾报道过通过 CIP 介导的转录激活因子BRD4募集来直接激活基因表达或表观遗传记忆的策略（https://www.nature.com/articles/s41586-023-06348-2）。对通过CIP诱导转录的蛋白质进行全基因组筛选，检测到通常参与转录延伸的几种激酶。许多临床阶段的小分子激酶结合剂可用，因此他们探讨了通过其激酶亚基募集转录延伸复合物到与BCL6结合的DNA序列是否可能激活BCL6抑制的细胞死亡。作者设计了一种基于 CIP 的通用策略（图2A）来募集内源性CDK9和其他延伸因子激酶，以诱导淋巴瘤细胞中BCL6调节的死亡基因的转录。当与BCL6的配体连接时，ATP竞争性激酶抑制剂转化为纳摩尔转录激活剂BTB系列.这种分子称为CDK-TCIPs（CDK转录/表观遗传学邻近化学诱导剂），通过快速重新定位CDK9的一部分、在 BCL6 结合基因座形成三元复合物、诱导 Pol II Ser 2 磷酸化（Pol II Ser 2 phos）和促凋亡的BCL6靶基因转录来运作。细胞杀伤作用在恶性和正常免疫学环境中均对 BCL6 驱动的细胞具有特异性。作者还说明了一系列连续的靶向检测，以可预测开发功能获得性 CDK-TCIPs，以将CDK9、CDK12和CDK13的七种不同临床阶段激酶抑制剂转化为环境特异性的转录诱导剂。总的来说，我们的CDK-TCIP方法突出了一种重定向而不是抑制激酶活性的策略，具有潜在的治疗效果。![]()
图2：CDK-TCIP 的开发
推断P-TEFb复合物与启动子的接近足以激活BCL6靶基因（图2A），作者合成了一个二价分子库，其中CDK9抑制剂和BCL6配体BT系列通过不同长度和化学成分的接头连接。筛选得到一种先导化合物CDK-TCIP1，它是使用CDK9抑制剂SNS-032和BCL6 构建的BT系列-结构域配体BI3812（图2B）。在依赖于高 BCL6表达的DLBCL细胞系中，CDK-TCIP1具有强大的细胞杀伤作用，平均有效浓度（EC50）在72小时的细胞活力测定中为 7.7 nM（图2D）。CDK-TCIP1的细胞毒性比CDK9和BCL6亲本抑制剂的加法效应大~55 倍，比阴性对照的加法效应高>10,000 倍（图2D）。在对859种不同癌细胞系的分析中，CDK-TCIP1在DLBCL细胞系中具有独特的效力，这取决于由于BCL6 基因或其调节区域（如因致癌突变而具有高水平的 BCL6 表达，表明 CDK-TCIP1 效力需要BCL6（图2E））。与使用 BRD4抑制剂设计的BCL6定向二价化合物相比，CDK-TCIP1对表达BCL6的DLBCL细胞更具特异性。在取自人扁桃体的原代T和B淋巴细胞中，CDK-TCIP1的细胞毒性比SUDHL5 DLBCL细胞低 200 倍。这与优化的CDK9降解剂和抑制剂形成鲜明对比，后者广泛抑制转录，并且在原代淋巴细胞和 DLBCL 细胞中同样有效（图2F ）。结果表明，CDK-TCIP 策略提供癌细胞特异性作用，并克服与抑制或降解必需激酶相关的靶向毒性，从而可能实现治疗窗口。BCL6的滴定BTB系列抑制剂BI3812或CDK9抑制剂SNS-032针对恒定的、致命的CDK-TCIP1剂量会损害细胞杀伤作用，表明观察到的细胞毒性需要CDK9和BCL6的伴随结合。因此，作者假设CDK9和BCL6之间的三元复合物形成是通过诱导BCL6靶基因杀死细胞所必需的。在合成的化合物中，掺入CDK9抑制剂SNS-032的二价分子在体外三元复合物形成和DLBCL细胞杀伤能力之间表现出最一致的结构-活性关系（图 3A）。![]()
图3：CDK-TCIP1通过三元复合物形成和CDK9活性重新定位到染色质上的BCL6发挥作用
先导分子CDK-TCIP1在纯化的BCL6之间形成三元复合物BTB系列和 CDK9-CycT1，EC5011 nM，并在DLBCL细胞中激活了BCL6控制的GFP表达，具有相当的EC50 58 nM（图3B）。在不含内源性BCL6的人胚胎肾SV40大T抗原转化 （HEK293T） 细胞中，CDK-TCIP1在过表达的全长CDK9和具有EC的全长BCL6构建体之间形成三元复合物50通过nanoBRET测定法测量为22 nM。在几乎所有的分析中，我们观察到高浓度二价分子饱和行为的钟形曲线特征。在相当剂量下，Neg1 和 Neg2 在转录激活报告基因和三元复合物形成测定中的作用可以忽略不计，证明了CDK9和BCL6双重结合的要求。总的来说，这些研究支持形成转录能力三元复合物的必要性，这对CDK-TCIP1 介导的 DLBCL 细胞杀伤至关重要。为了以无偏倚的方式评估 CDK-TCIP1 对内源性蛋白质的直接影响，我们通过用 30 nM CDK-TCIP1、Neg1和Neg2处理DLBCL细胞系SUDHL5 2小时进行整体蛋白质组分析，然后使用数据非依赖性采集平行积累连续碎裂对肽进行蛋白质消化和液相色谱-串联质谱分析，平均定量了169,000种肽和8100种独特蛋白质。与Neg1或Neg2处理的情况不同，CDK-TCIP1增加了细胞周期蛋白T1（CCNT1;>2倍）和T2 （CCNT2;>2 倍）、CDK9（1.8倍）和BCL6（1.2倍）的丰度，其他蛋白质的变化（>2倍）高于统计临界值（调整后P值= 0.05;图4C）。鉴于这些突出显示的蛋白质的处理时间短且 mRNA 丰度不变（图4C），这些丰度变化不太可能通过诱导转录发生。相反，数据支持 CDK-TCIP1 对 BCL6-P-TEFb 复合物进行热力学稳定或保护蛋白酶体降解。![]()
图4：凋亡信号的激活
为了评估募集的CDK9催化活性的功能重要性，作者通过过表达具有苯丙氨酸到缬氨酸突变（FKBPF36V系列）标记的野生型（WT）或突变型CDK9在BCL6对照的GFP 报告细胞系中。然后，他们合成了一种细胞渗透性二价化合物RCS-03-207，它连接了 FKBP的合成配体F36V系列（o-AP1867） 与BCL6BTB系列-结构域结合剂 BI3812。在该模型系统中，RCS-03-207处理对含有WT的融合构建体产生剂量依赖性GFP增加，对催化失活的 D167N突变体CDK9的反应显著降低。在催化失活的CDK9条件下检测到的适度GFP信号表明，共同募集额外的P-TEFb拷贝可能有很小的贡献。因此，募集具有酶功能、活性的CDK9可能是BCL6基因位点的CDK-TCIP依赖性转录激活的要求。假设扩散极限速率常数为~108M−1s−1和三元结合表观 EC50CDK-TCIP1在细胞内为~22 nM，三元复合物形成的关闭速率为 ~2.2 s−1，类似于 ADP从激酶活性位点释放的速率。因此，CDK-TCIP1三元复合物应该足够频繁地分解（大约每0.45秒一次），以允许在BCL6结合位点处进行催化活性。他们提出了一种潜在的“捕获和释放”机制，其中CDK-TCIP1募集并随后将具有催化活性的CDK9释放到BCL6基因座，以转录激活BCL6抑制的基因。这样的模型还可以解释最近对二价分子的研究，该研究通过底物竞争性抑制剂募集组蛋白脱乙酰酶活性。CDK9 活性重新定位到染色质上的 BCL6 靶标为了确定CDK-TCIP1对CDK9定位和活性对染色质的直接影响，作者在早期时间点（2小时）对用30 nM CDK-TCIP1处理的DLBCL细胞中进行CDK9的下一代测序 （ChIP-seq），使用加标的黑腹果蝇染色质进行标准化和定量CDK9水平的绝对变化。在此浓度下，参与细胞的总CDK9或BCL6的百分比远低于它们各自的抑制剂。在SUDHL5 和 KARPAS422 DLBCL细胞系中重建了大约10,000 个CDK9 峰，用两种不同的 CDK9 抗体检测到，生物学重复之间具有很强的相关性，并且大部分差异是由 CDK-TCIP1 处理驱动的。CDK-TCIP 导致CDK快速而稳健地募集到SUDHL5和KARPAS422细胞染色质上的 BCL6 结合位点（图3D）。CDK9局部量的增加与BCL6富集的增加相关，证实了BCL6对染色质的依赖性募集。在其启动子的转录起始位点（TSS）3 kb 范围内具有高置信度 BCL6 结合峰的基因在启动子和整个基因体上显示出三倍的 CDK9，而其他基因在背景上的变化可以忽略不计（图3E）。CDK9被招募到BCL6峰会的启动子和增强子中;没有BCL6的区域显示CDK9占有率适度增加或没有变化。在 SUDHL5 细胞中，CDK9结合峰增加的5倍（604个，占所有11,716个峰的5.1%）是减少的峰数（142个，占所有11,716个峰的1.2%），通过使用相对对数表达归一化的差异峰分析计算。这与图 2C中表明CDK9蛋白稳定的全球蛋白质组学结果一致。这些分析的结果表明，CDK9被快速、特异性地募集到 BCL6 结合的染色质中。为了确定将CDK9重新定位为BCL6结合基因座在染色质上的直接后果，他们在添加CDK-TCIP1后2小时和4小时表征 Pol II 的变化及其C末端结构域在Ser 2和Ser 5 位点的磷酸化（30 nM）。主要在启动子处诱导选定数量的Pol II Ser 2磷酸化峰（306个峰向上，调整后的P ≤ 0.05，倍数变化≥ 1.4;图3F）。在2小时和4小时时Pol II Ser 2 phos 中增加的峰富集了化合物诱导的CDK9结合，而那些减少或保持不变的峰在CDK9水平上的变化可以忽略不计（图3G）。在诱导最多的Pol II Ser 2磷酸酶位点中，已知的 BCL6 抑制的细胞死亡和肿瘤抑制基因，如PMAIP1、BIK（BCL2 相互作用杀伤基因）、HRK （Harakiri）和 CDKN2B（图3F和H）。与基因座特异性活性机制一致，4小时CDK-TCIP1处理不会全局改变Pol II Ser 2磷酸化或BCL6、CDK9或Pol II蛋白丰度，通过免疫印迹确定，除非浓度比细胞杀伤EC大10倍50应用，这与全局蛋白质组分析（图2G）和nanoBRET 置换数据一致。在其转录起始位点或其他位置的BCL6位点的基因上，Pol II总丰度几乎没有变化。他们的数据支持一种功能获得机制，其中CDK-TCIP1将细胞CDK9的一部分重新定位到BCL6结合的基因座。在CDK-TCIP1的SUDHL5细胞（10、30或100 nM）中短暂处理（2或4小时）后通过RNA测序进行转录组分析，确定了一组603个基因，这些基因显示转录显着增加（调整后 P ≤ 0.05和2倍数变化≥）和较少（n = 404）表达降低（图4A）。转录增加的基因富集了多个注释的 BCL6 靶基因集（图 4B）。BCL6 信号转导的基因表达变化和富集是剂量依赖性的。CDK-TCIP1增加了mRNA中促凋亡、包含 BH3（BCL2同源3）结构域、BCL6 靶基因的表达，包括BBC3（BCL2 相互作用蛋白3;也称为PUMA，用于p53上调的细胞凋亡调节剂）和PMAIP1（也称为NOXA），以及细胞周期停滞基因 CDKN1B （p27）（调整后的 P ≤ 0.05），是DMSO对照的1.6倍以上（图4C））。此外，另外两个促凋亡基因 BAX（BCL2相关X，凋亡调节因子）和BIM（BCL2相互作用的细胞死亡介质;也称为BCL2 的BCL2L11）的mRNA显示出统计学意义，比对照高出1.2倍。抗凋亡 MCL1（髓系细胞白血病序列1）也增加了20%。这些基因还显示CDK9的募集和Pol II Ser 2 磷酸化增加（图3、F 和 H）。在两种不同的细胞系（SUDHL5和KARPAS422）中观察到其中一些靶标在蛋白质水平上的诱导，但在幅度上是微弱的。p53介导的细胞死亡所需的仅BH3蛋白PUMA的小幅增加与另一种仅BH3蛋白NOXA的增加同时发生。仅含BH3的蛋白累积作用以启动细胞死亡。这些观察结果可能表明，含有BH3结构域的促凋亡蛋白过量超过抗凋亡蛋白可能是导致细胞死亡的原因。对于p27，诱导小且延迟，表明增加反映了细胞周期阻滞，并且沿其基因体的Ser 2磷酸化快速增加（在2小时时）和基因表达（图4C）可能反映了其他调节机制。24小时后 Annexin V染色显示，CDK-TCIP1诱导EC的SUDHL5细胞剂量依赖性细胞凋亡50340 nM（图4D）。相比之下，在该测定中，需要高浓度的阴性对照Neg1和 Neg2浓度10至1000倍，这与它们对基因转录（图4D）的影响可以忽略不计一致。因此，CDK-TCIP1激活了BCL6抑制的死亡途径，这与化合物的合理优化一致，以诱导 BCL6 抑制的转录。对用CDK-TCIP1（30 nM）处理细胞后转录本减少的调查显示，这些是与GC B细胞程序相关的基因，其中BCL6是其主要调节因子。BCL6本身在其第一个内含子中包含一个BCL6结合位点，并且是自动调节的，其启动子处的Pol II Ser 2磷酸化略有降低，而CDK9、Pol II和Pol II Ser 5磷酸化增加，表明Pol II开始但暂停。用CDK-TCIP1（30 nM）处理后4小时，BCL6表达下降了~12%（校正 P = 0.003），但在此时间点和剂量下蛋白水平没有变化。CDK9在这些基因座和其他基因座上的增加，但与转录延伸相关的标记减少，可能反映了CDK9在沉默基因表达中的非经典作用。将CDK-TCIP概念扩展到CDK12和CDK13作者通过开发募集转录激酶CDK12和CDK13的分子来探索重定向激酶活性的策略的可预测性（图5A），与CDK9类似，它们磷酸化 Pol II Ser 2 并有助于转录延伸 。在某些癌症中，CDK12和CDK13因扩增或突变而失调。他们合成了 CDK-TCIP3，这是一种将CDK12和CDK13的有效选择性抑制剂与BCL6连接起来的分子BTB系列配体 BI3812（图 5B）。与CDK9相比，CDK-TCIP3对CDK12和CDK13的亲和力高出5倍 （CDK13-CycK IC50~65 nM，CDK9-CycT1 IC50~261 nM） 并有效增加 BCL6 抑制的GFP的表达，表现出CIP功能的特征性钟形曲线特征（图5C）。CDK-TCIP3与EC 一起表现出细胞杀伤作用处理 72 小时后，SUDHL5 细胞中EC50~609 nM，比单独使用CDK12和CDK13抑制剂在这些细胞中的作用大10倍以上（图5D）。这些研究表明，CDK9以外的转录激酶抑制剂可以合理地转化为细胞死亡的激活剂。![]()
图5.将CDK-TCIP概念扩展到CDK12和CDK13
总的来说，作者开发了CDK-TCIPs，这是一种化学诱导的基于邻近的功能获得策略，通过将转录激酶活性重新定位到与过表达的致癌转录因子BCL6结合的促凋亡基因位点来激活细胞凋亡。这些二价分子通过募集延伸激酶活性来发挥作用。这项工作代表了重新连接内源性激酶活性以在体内驱动治疗相关表型的第一个例子。
