PDE3A-SLFN12分子胶在TKI耐药胃肠间质瘤中表现出显著的抗肿瘤活性
文摘
2024-07-05 09:38
北京
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6月12日，来自日本的研究团队在Clinical Cancer Research报道了一个对TKI耐药的GIST有治疗潜力的小分子OPB-171775。通过对敏感细胞的遗传背景进行研究，确定了OPB-171775是PDE3A与SLFN12的分子胶。OPB-171775通过诱导PDE3A与SLFN12的相互作用，激活SLFN12的RNase活性，从而在多种GIST PDX模型中展现出显著的抗肿瘤效果，其疗效不依赖于KIT或PDGFRA基因的突变状态。作者通过对细胞表型的筛选，发现了PDE3A抑制剂衍生物能够选择性地抑制包括黑色素瘤、宫颈癌和神经母细胞瘤细胞在内的几种类型的癌细胞的增殖。因此，作者继续对这些衍生物进行成药性优化，最终鉴定出OPB-171775。![]()
作者首先评估了OPB-171775在一系列PDX模型中的体内抗癌活性。选择了涵盖9种癌症类型的46个PDX模型，这些模型表现出相对较高的PDE3A表达水平。作者采用了“每个模型每处理一只小鼠”的方法来进行体内筛选。OPB-171775治疗导致所有9个GIST PDX模型的肿瘤体积出现消退，而对照组则导致除一个模型外所有模型在治疗期间肿瘤生长。OPB-171775治疗还导致了子宫、卵巢、肺、肉瘤和黑色素瘤肿瘤的PDX模型的退缩。在混合性腺瘤、脑、胆囊和肾脏PDX中未观察到肿瘤退缩。![]()
GIST模型包括具有不同KIT突变状态的PDX。因此，作者接下来测试了不同的KIT突变是否赋予了对OPB-171775不同程度的敏感性。在仅携带主要的外显子11突变的GS11353 PDX模型中，伊马替尼如预期地抑制了肿瘤生长。然而，它对携带外显子13和外显子17突变的PDX GS5107和GS5108几乎没有影响。这些结果与继发性KIT突变导致对伊马替尼的抗性的观点相符。相比之下，OPB-171775在这三个模型中均显示出与剂量相关的抑制效果，无论KIT突变状态如何。作者还使用了几个表达PDE3的癌细胞系来评估OPB-171775的体外和体内效果。OPB-171775在几种癌症类型中表现出强大的抗增殖活性。在传统的皮下异种移植模型中，OPB-171775以剂量依赖性的方式抑制了PFSK-1和NCI-H2122肿瘤的生长。连续14天每天口服高达0.3毫克的OPB-171775剂量，对动物体重没有明显不良影响。PDE3A和SLFN12的共表达对于OPB-171775的抗癌活性至关重要为了进一步阐明OPB-171775的选择性，作者在一系列浓度（从1 μmol/L到0.15 nmol/L，3倍稀释）下处理了554个细胞系72小时。使用药物浓度-细胞活性曲线下的面积（AUC）来评估细胞对OPB-171775的敏感性，其中有17个细胞系对OPB-171775异常敏感。然后，作者利用CCLE的mRNA表达数据，检查了OPB-171775敏感性与PDE3A和其他可能涉及的基因表达之间的相关性。通过计算皮尔逊相关系数的绝对值，选出了前100个基因。在这100个基因中，PDE3A排名第一，皮尔逊相关系数为-0.44。然而，尽管PDE3A表达高，仍有几个细胞系被鉴定为耐药。因此，作者调查了是否还有其他因素参与了OPB-171775的敏感性。作者使用AUCs和前100个基因的mRNA表达值进行多元回归分析，并使用逐步选择法，选出了具有统计学意义的13个变量。在这些变量中，回归模型中贡献最大的两个变量是PDE3A表达和SLFN12表达。![]()
接下来，作者研究了SLFN12表达在OPB-171775敏感性中的参与情况。SLFN12编码Schlafen 12蛋白，作者将554个细胞系根据PDE3A和SLFN12表达的临时截止值4.569和7.012分为4组（双阳性、PDE3A阳性/SLFN12阴性、PDE3A阴性/SLFN12阳性和双阴性）。作者发现双阳性组在OPB-171775敏感的细胞系中显著富集（图2c）。![]()
然后，作者评估了基因表达扰动对OPB-171775敏感性的影响。在PDE3A阴性的U251MG细胞和SLFN12阴性的GIST-T1细胞中，PDE3A和SLFN12的过表达分别导致对OPB-171775的敏感性。当比较具有不同SLFN12 mRNA表达水平的GIST-T1克隆时，较高的SLFN12表达与对OPB-171775的更大敏感性相关。相反，使用siRNA敲低PDE3A或SLFN12在PFSK-1和GIST-T1-SLFN12细胞中导致对OPB-171775的抗性。![]()
作者还使用对OPB-171775敏感的NCI-H2122细胞进行了CRISPR筛选，以寻找敲除后能赋予对OPB-171775抗性的基因。在这个无偏的基因组范围内筛选中，SLFN12和PDE3A被鉴定为高度排名的正向选择基因。与上述发现一致，作者证实了对OPB-171775敏感的GIST PDX模型表现出可检测的基本mRNA表达水平的PDE3A和SLFN12，这一点通过RNA-seq Log2(FPKM)值大于零以及原位杂交结果得到证实。![]()
OPB-171775是PDE3A与SLFN12的分子胶在该研究进行的同时，Waal等人报道了一些PDE3A抑制剂，例如DNMDP，对共表达PDE3A和SLFN12的细胞显示出选择性抗癌活性。他们还证明了DNMDP与PDE3A的结合促进了PDE3A和SLFN12之间的相互作用。由于DNMDP的这些特性与OPB-171775相似，于是作者测试了OPB-171775是否促进PDE3A和SLFN12之间的相互作用。结果如预期，在PFSK-1和HeLa细胞中，OPB-171775诱导了PDE3A与SLFN12互作。 ![]()
此外，OPB-171775治疗增加了PDE3A/SLFN12双阳性细胞系中的SLFN12蛋白水平，而在PDE3A阴性细胞系中没有，尽管在OPB-171775处理后没有观察到SLFN12 mRNA表达的明显诱导。因此，作者评估了SLFN12蛋白在GIST-T1-SLFN12细胞中的周转率，这些细胞中SLFN12被异位表达，以调查OPB-171775处理后SLFN12积累的机制。尽管SLFN12被强制表达，SLFN12蛋白水平在细胞中仍然很低，使用蛋白酶体抑制剂处理显著增加了SLFN12蛋白水平，这暗示SLFN12蛋白被泛素-蛋白酶体系统降解。然而，OPB-171775处理即使在用环己亚胺阻断蛋白合成时也增加了SLFN12蛋白水平。这些数据表明OPB-171775通过促进PDE3A和SLFN12之间的相互作用防止了SLFN12的降解。![]()
为了阐明SLFN12的RNase活性而不是PDE3A的酶抑制在OPB-171775的抗癌活性中的作用，作者用Cilostamide，一种强效但相对非细胞毒性的PDE3A抑制剂，与OPB-171775联合处理PFSK-1细胞。Cilostamide以浓度依赖性的方式减弱了OPB-171775的抗癌活性。与体外结果一致，尽管PDE3A表达水平高，但Cilostamide在GS11353 PDX模型中抵消了OPB-171775的抗肿瘤活性。这些结果表明，PDE3A的酶抑制本身与OPB-171775的抗癌活性无关。最近的一项研究表明，SLFN12作为一种RNase发挥作用，并且这种功能对于DNMDP的抗癌活性至关重要。这一观察促使作者调查RNase活性是否也驱动了OPB-171775的抗癌活性。作者使用GIST-T1细胞，这些细胞内源性SLFN12表达非常低，因此对OPB-171775不敏感，来评估表达RNase死亡突变体SLFN12对OPB-171775敏感性的影响。虽然野生型SLFN12的表达使GIST-T1细胞对OPB-171775敏感，但表达RNase死亡突变体E200A和E205A对细胞活性没有显著影响。这些突变并没有消除SLFN12与PDE3A形成复合物的能力或在OPB-171775处理后在细胞内积累的能力。这些结果表明，OPB-171775的抗癌活性是通过SLFN12的RNase活性介导的，与DNMDP的作用机制相似。OPB-171775通过SLFN12 RNase活性干扰翻译机制，导致GCN2及其下游信号通路的激活为了进一步阐明SLFN12 RNase的功能，作者采用了转录组方法，通过微阵列分析。OPB-171775处理改变了对照细胞中众多基因的表达，但在SLFN12敲低的细胞中没有变化，突出了SLFN12作为OPB-171775抗癌活性的效应因子的作用（图4a）。基于微阵列数据的基因集富集分析（GSEA）揭示了与核糖体功能和内质网（ER）应激反应相关的基因集在OPB-171775处理的细胞中与DMSO处理的细胞相比有显著富集。由于ER应激反应通常是由传感器蛋白在检测到未折叠或错误折叠的蛋白质时启动的，作者调查了参与这些反应的传感器蛋白的激活情况。OPB-171775在PFSK-1细胞中诱导了GCN2的磷酸化，以及GCN2介导的应激反应的关键下游分子ATF4和DDIT3的表达，而在缺乏内源性PDE3A表达的U-87MG细胞中则没有。![]()
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GCN2抑制剂GCN2iB完全阻断了OPB-171775诱导的GCN2激活和下游信号传导，而PERK抑制剂GSK2606414则没有。在对OPB-171775的反应中，GCN2在传感器蛋白中的主导作用也在表达野生型SLFN12的GIST-T1细胞中观察到。此外，在使用单一剂量口服OPB-171775后，PFSK-1肿瘤和GS11353 PDX肿瘤中GCN2磷酸化和下游信号的类似诱导也在时间上观察到。![]()
OPB-171775抑制细胞周期进展并诱导细胞死亡据报道，GCN2介导的应激反应可以促进细胞存活，但过度和适应不良的GCN2激活也可能导致细胞凋亡。因此，作者调查了GCN2激活是否参与了OPB-171775在PFSK-1细胞中的抗癌效果。细胞周期分析显示，至少1 nmol/L浓度的OPB-171775处理减少了S期细胞群体，表明G0/G1期停滞。与Cilostamide联合治疗几乎完全逆转了这种细胞周期停滞，与之前的增殖实验结果一致。相反，与GCN2抑制剂联合治疗在统计上显著但适度地减弱了S期细胞群体的减少，表明GCN2激活至少部分参与了OPB-171775的抗癌效果。![]()
WB分析显示，OPB-171775处理在PFSK-1细胞中上调了p21（CDKN1A）并下调了cyclin D1（CCND1）和E2F1。与OPB-171775和GCN2抑制剂联合治疗对p21水平有适度影响，但显著上调了cyclin D1和E2F1，它们的转录活性刺激细胞从G1期到S期的细胞周期进展。这些数据可能解释了OPB-171775诱导的G0/G1期停滞和GCN2抑制剂联合治疗诱导的细胞周期重新进入的分子机制。此外，OPB-171775上调了促凋亡的PUMA（BBC3）并下调了抗凋亡的MCL1（图5b）。与其对细胞周期调节分子的影响相反，OPB-171775和GCN2抑制剂的联合治疗对OPB-171775诱导的PUMA上调和MCL1下调几乎没有影响，并且未能抑制caspase-3的裂解。流式细胞分析显示，48小时的OPB-171775处理显著增加了Annexin V阳性/碘化丙啶（PI）阴性（凋亡）和Annexin V阳性/PI阳性（坏死）细胞的数量。![]()
因此，上述描述的多种作用机制，包括GCN2应激信号、细胞周期停滞和诱导细胞死亡，被认为涉及OPB-171775的抗癌活性。![]()
OPB-171775对GISTs中KIT信号传导的减弱以及与伊马替尼联合治疗的效果考虑到OPB-171775对GIST PDXs的显著抗癌活性，作者研究了OPB-171775的抗癌作用机制与GISTs中肿瘤源性KIT信号传导之间的潜在串扰。尽管OPB-171775 2小时处理并未抑制KIT磷酸化及其下游效应子如AKT和ERK1/2，这反映了OPB-171775的非TKI特性，但24小时处理降低了KIT蛋白的磷酸化和总水平以及下游KIT信号传导，表明在OPB-171775对GISTs的强效抗癌活性中可能存在额外的作用机制，涉及KIT的下调。 ![]()
作者进一步比较了伊马替尼和OPB-171775在GIST细胞中抑制细胞生长和诱导细胞死亡的程度和动力学。虽然据报道伊马替尼增加了GIST-T1细胞中的G0/G1期比例，但OPB-171775在GIST-T1-SLFN12细胞中24小时后增加了G2/M期细胞群体的大小。活细胞成像显示，两种化合物都以浓度依赖性方式抑制了细胞生长。然而，与伊马替尼不同，OPB-171775的抑制效果有10-20小时的延迟。伊马替尼在整个测试期间显示出细胞静息效应，而OPB-171775在24小时后引发了显著的细胞死亡。这些数据表明OPB-171775表现出由KIT抑制单独无法实现的延迟性细胞毒性。 ![]()
因此，作者研究了OPB-171775和伊马替尼的联合治疗在体外和体内的效果。GIST-T1-SLFN12细胞与OP171775和伊马替尼的联合治疗具有相加的抑制效果。在GS11353 PDX模型中，单药治疗0.03 mg/kg OPB-171775每日一次或50 mg/kg伊马替尼每日两次导致肿瘤生长持续抑制，而联合治疗导致整个肿瘤携带小鼠队列的肿瘤显著退缩，即使在停药后也导致所有治疗小鼠的肿瘤完全根除。![]()
OPB-171775作为一种新型非TKI化合物，通过诱导PDE3A与SLFN12之间的相互作用，激活SLFN12的RNase活性，从而在多种GIST PDX模型中展现出显著的抗肿瘤效果，其疗效不依赖于KIT或PDGFRA基因的突变状态。研究揭示了OPB-171775诱导的GCN2激活及其下游信号通路在抗癌活性中的关键作用，同时发现KIT信号传导的下调可能是OPB-171775在GIST治疗中的另一作用机制。此外，与伊马替尼的联合治疗在GIST模型中实现了肿瘤的完全根除，为未来临床治疗提供了新的方向。尽管OPB-171775展现出治疗潜力，但其在SDH缺陷型GISTs中的疗效及PDE3A和SLFN12表达水平对疗效的具体影响仍需进一步研究。OPB-171775为TKI耐药的GIST患者提供了新的治疗策略，并为后续的临床评估奠定了基础。本文作者：ZZY
