eRF1降解剂 SRI-41315在核糖体解码中心充当分子胶
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科技
2024-01-25 10:19
北京
2024年1月3日，哈佛医学院Sichen Shao课题组在Nature Chemical Biology上发表了一篇题为The eRF1 degrader SRI-41315 acts as a molecular glue at the ribosomal decoding center的文章。冷冻电镜结构表明，SRI-41315 在负责终止密码子识别的eRF1 N结构域和解码中心附近的核糖体亚基界面之间充当金属依赖性分子胶。SRI-41315将eRF1保留在核糖体上会导致核糖体碰撞、eRF1泛素化和近同源终止密码子处翻译终止的频率更高，该研究结果揭示了释放因子抑制的新机制。![]()
蛋白质合成的准确终止对于建立高质量的蛋白质组至关重要。真核生物的翻译终止需要eRF1蛋白，它介导翻译终止过程中终止密码子识别、新生蛋白释放和核糖体再循环。eRF1能识别核糖体上所有三个终止密码子（UAA、UAG 和 UGA），诱导一种紧凑的信使 RNA（mRNA）构象。该构象将四个核苷酸（包括终止密码子后面的核苷酸）挤压到核糖体A位点。eRF1蛋白还有一种具有突变GGQ基序的变体称为eRF1（AAQ）。过早的翻译终止会导致强烈的功能丧失表型，还可能产生具有有害功能的截短蛋白。目前已报道有几种小分子可诱导eRF1降解并增强过早终止密码子的通读。SRI-41315是首批从翻译通读筛选中鉴定出的eRF1降解剂之一，其介导的 eRF1降解依赖于RNF14和RNF25两种泛素连接酶。作者首先对SRI-41315的作用机制进行研究。在无细胞哺乳动物翻译系统中，SRI-41315以剂量依赖性方式抑制放射性标记的蛋白质合成。加入SRI-41315会产生比全长模型蛋白小的明显放射性标记产物。针对N端3×Flag标签的免疫沉淀特异性富集后发现，它们是模型蛋白的C端截短形式。同时，在SRI-41315作用下，合成的新生蛋白不会附着在tRNA上，而是从核糖体中释放出来。相反，用过量的eRF1（AAQ）产生的停滞翻译中间体，或从编码相同蛋白质序列的不间断mRNA中产生的停滞的翻译中间体，显示出与核糖体保持相关的肽基-tRNA加合物。这说明SRI-41315 抑制翻译，但不抑制多肽释放。![]()
接下来，作者分析了SRI-41315如何影响无细胞翻译系统中的eRF1，重点关注 eRF1 泛素化和与核糖体的结合。体外翻译反应表明，SRI-41315以剂量依赖性方式特异性诱导eRF1泛素化（图2）。SRI-41315依赖性eRF1泛素化比在无细胞系统中合成约20kDa蛋白所需的时间慢约4倍，这种动力学差异表明RNF14介导的降解途径选择性靶向异常保留在核糖体上的翻译因子。在SRI-41315存在下，未修饰和泛素化的eRF1优先保留在核糖体上。SRI-41315对eRF1的稳定会产生停滞的翻译终止复合物，导致RNF14介导的泛素化和被捕获的eRF1的降解。![]()
图2 SRI-41315在体外抑制蛋白质合成并诱导eRF1泛素化随后，作者解析了SRI-41315在终止核糖体上的冷冻电镜结构。结构表明，SRI-41315在核糖体解码中心附近结合，位于eRF1的α2、β1和β4、18S核糖体RNA（rRNA）的U1827和C1828的磷酸骨架以及28S rRNA的3760位（A2M-3760）的A3759和2′-O-甲基腺苷的口袋中。SRI-41315通过多次相互作用稳定在这个位置。首先，镁离子紧密配位SRI-41315的并列羰基、A2M-3760骨架的非桥接氧和28S rRNA的A3759以及可见的水分子（图3）。其次，SRI-41315夹在eRF1 α2上的Met51和28S rRNA的A2M-3760之间。第三，SRI-41315的环丁基与Tyr125在eRF1的β4上堆积。因此，SRI-41315创建了一个金属依赖性相互作用网络，将eRF1 N结构域锚定到核糖体亚基界面。![]()
图3 SRI-41315 在终止核糖体上的冷冻电镜结构作者还进一步研究了SRI-41315相互作用对eRF1降解的影响。在与SRI-41315接触的两个eRF1残基中，Tyr125是不变的，对终止密码子识别至关重要。Met51高度保守，但并不严格保守，具有诱变的可行性。由于上述 Met51与SRI-41315的嘧啶酮之间的构象变化和疏水相互作用，作者假设Met51 突变可能影响SRI-41315诱导的eRF1降解的效力。为了测试这一点，他们使用了流式细胞术测定法监测暴露于浓度递增的SRI-41315的细胞中3× Flag-eRF1（野生型，M51A或M51R）的水平。其中，Met51突变为Ala导致SRI-41315效力增加约三倍，而突变为Arg具有相反的效果，赋予增加的耐药性。与WT eRF1类似，SRI-41315诱导的Met51突变体降解在RNF14敲除细胞中被消除。总体而言，诱变结果与结构模型一致，表明Met51在SRI-41315结合中起重要作用。Met51 突变为 Ala消除了环丁基部分的空间障碍，而该位置的Arg则不受欢迎，可能是因为它靠近 Arg47 并且镁离子与 SRI-41315 结合。 ![]()
图4 SRI-41315对eRF1和解码中心的影响。总的来说，该文章发现了一种eRF1小分子降解剂SRI-41315能作为分子胶增强核糖体上和eRF1的相互作用，且区别于与大多数作用于两个多肽界面的分子胶，SRI-41315占据一个由eRF1、28S rRNA和18S rRNA多种成分形成的口袋。本文作者：HYN
