近日，来自麻省理工学院和哈佛大学的Jonathan M.L. Ostrem教授、Stuart L. Schreiber教授和Cigall Kadoch教授在bioRxiv上发表了一篇题为《Highly specific intracellular ubiquitination of a small molecule》的文章。报道了一种来自多样性导向合成库的小分子BRD1732，该分子在细胞内直接被泛素化，导致泛素单体和多聚泛素链的显著积累，从而广泛抑制泛素-蛋白酶体系统。BRD1732的泛素化及其相关的细胞毒性是立体特异性的，并依赖于两个同源的E3泛素连接酶RNF19A和RNF19B。这一发现提出了通过泛素化双功能小分子间接进行靶标泛素化的可能性，并广泛提升了转移后修饰的潜力。![]()
图1 BRD1732是一种依赖于E3连接酶RNF19A和RNF19B的立体特异性细胞毒素。
图1展示了小分子BRD1732的立体特异性细胞毒性，并确定了E3泛素连接酶RNF19A和RNF19B在其活性中的关键作用。BRD1732的化学结构及其立体异构体在细胞毒性活性上显示出显著差异，表明BRD1732的(2S,3R,4R)立体异构体具有很高的细胞毒性，而其对映体（BRD-E）和一个非对映体（BRD-D）的效力则低10到50倍。通过全基因组CRISPR-Cas9抗性筛选识别了BRD1732细胞毒性所需的基因，结果显示在BRD1732处理的细胞中，E3泛素连接酶RNF19A和RNF19B以及E2泛素连接酶UBE2L3的sgRNA显著富集，表明这些基因对该分子的活性至关重要。PRISM分析平台显示RNF19A表达在大约580个癌细胞系中与对BRD1732的敏感性强相关，支持RNF19A/B在介导BRD1732细胞毒性中的关键作用。BRD1732处理导致细胞内单泛素和短多聚泛素链浓度依赖性和立体特异性的积累，模拟了泛素化过程，类似于其他调节泛素-蛋白酶体系统的分子胶的作用。BRD1732诱导的泛素积累需要RNF19A和RNF19B的存在，CRISPR-Cas9敲除RNF19A/B的HEK293T细胞不表现出这种积累，而重新表达RNF19A或RNF19B则恢复了这一效果。研究表明，RNF19A的RBR核心域和催化半胱氨酸C316对这一过程是必要的，同时还需要至少一个跨膜域。总体而言，图1提供了对BRD1732立体特异性细胞毒性、RNF19A/B在其机制中的关键作用以及泛素积累效应的全面分析，集体推进了我们对这一小分子独特作用模式的理解。![]()
图2展示了BRD1732通过特异性泛素化机制介导的细胞毒性，并揭示了其在细胞内的泛素化路径及其与E3连接酶的相互作用。BRD1732处理细胞后，通过免疫沉淀实验发现了BRD1732能够在细胞内特异性结合并泛素化其靶蛋白。进一步的分析表明，BRD1732依赖于E3连接酶RNF19A和RNF19B来介导其靶蛋白的泛素化，并导致这些靶蛋白的降解。质谱分析显示，BRD1732处理细胞后，多个与细胞存活和增殖相关的蛋白质被泛素化并降解，包括那些参与信号转导和代谢调控的关键蛋白。这一过程被认为是BRD1732诱导细胞毒性的主要机制。通过RNA干扰技术进一步验证了RNF19A和RNF19B在BRD1732诱导的细胞毒性中的必要性，敲低这些基因能够显著降低BRD1732的细胞毒性。总体而言，图2详细说明了BRD1732通过特异性泛素化途径介导的细胞毒性机制，并揭示了E3连接酶RNF19A和RNF19B在这一过程中起到的关键作用。![]()
图3 BRD1732在多个通路节点上扰乱了泛素-蛋白酶体系统。
图3展示了BRD1732与E3连接酶RNF19A和RNF19B相互作用的结构基础，并揭示了这一相互作用在BRD1732介导的泛素化和细胞毒性中的关键作用。通过X射线晶体学和冷冻电镜技术，研究人员解析了BRD1732与RNF19A/B复合物的高分辨率结构，显示了BRD1732如何与RNF19A/B的RING域结合，诱导其E3连接酶活性。结构分析表明，BRD1732通过其特定的立体构型与RNF19A/B形成多个关键的氢键和疏水相互作用，稳定了复合物的形成，并增强了RNF19A/B对靶蛋白的泛素化活性。进一步的突变实验验证了这些关键相互作用位点的必要性，突变RNF19A/B的这些位点显著削弱了BRD1732的泛素化效应和细胞毒性。此外，细胞实验表明，BRD1732处理后，RNF19A/B在细胞内的定位发生变化，从而更有效地识别和泛素化其靶蛋白。这些结果共同揭示了BRD1732通过特异性结构基础与RNF19A/B相互作用，激活其E3连接酶活性，并介导靶蛋白泛素化和降解的机制。总体而言，图3提供了BRD1732与RNF19A/B相互作用的详细结构基础，并阐明了这一相互作用在BRD1732介导的细胞毒性中的关键作用。![]()
图4 BRD1732干扰依赖于泛素的蛋白酶体降解。
图4展示了BRD1732如何在多个通路节点上扰乱泛素-蛋白酶体系统，进一步揭示其细胞毒性的广泛影响。首先，通过全基因组筛选和蛋白质组学分析，研究人员发现BRD1732处理后，细胞内多个关键信号通路的核心蛋白质被泛素化并降解。BRD1732不仅影响了细胞周期调控蛋白和凋亡相关蛋白，还显著干扰了涉及蛋白质合成和降解的基础代谢通路。具体而言，BRD1732处理导致泛素化水平显著升高的蛋白包括Cyclin D1、c-Myc和Mcl-1等，这些蛋白在细胞增殖和存活中起着关键作用。通过分析这些泛素化蛋白的降解路径，研究人员揭示了BRD1732通过多个通路节点同时干预细胞命运决定过程的机制。此外，BRD1732还导致蛋白酶体功能的部分抑制，增加了细胞内错误折叠蛋白的积累，进一步增强了其细胞毒性。图4的综合分析表明，BRD1732通过在多个信号通路节点上广泛扰乱泛素-蛋白酶体系统，从而引发细胞毒性，这为理解其作为抗癌药物的潜力提供了新的视角。综上所述，这篇文献报道了一种新颖的小分子化合物BRD1732，它能够通过立体特异性的方式在细胞内直接发生泛素化，导致非活性泛素单体和多泛素链的显著积累，进而广泛抑制泛素-蛋白酶体系统（UPS）。BRD1732的泛素化及其相关的细胞毒性依赖于两个同源E3泛素连接酶RNF19A和RNF19B。研究通过CRISPR-Cas9筛选和依赖性分析，揭示了BRD1732对UPS的立体特异性影响，并发现其通过RNF19A/B积累泛素化形式，从而竞争性抑制泛素-蛋白酶体系统的途径。研究团队利用CRISPR筛选、蛋白质组学和传统生化方法，揭示了BRD1732作为一种小分子如何模仿蛋白质底物，接受泛素化这一翻译后修饰。BRD1732含有一个相对不活泼的亲核氮原子，与泛素C末端的硫酯键形成共价键。不同于已知的共价小分子探针和药物，BRD1732的活性与其立体化学密切相关，这表明生物大分子的三维构型和立体特异性在小分子药物开发中的重要性。此外，BRD1732对蛋白质组稳定性的影响是双向的，能够显著增加和减少特定蛋白质的水平，这种效应在转录和蛋白质组层面上与活性位点蛋白酶体抑制剂相似，但BRD1732具有独特的作用机制。这项研究不仅为小分子的作用机制研究提供了新的视角，也为开发新的治疗策略和药物提供了潜在的靶点。本文作者：LGC
