分子胶降解剂通过Nedd4-1靶向降解K-Ras突变体
文摘
2024-05-14 17:21
北京
近期发表在生物预印本上的一篇名为“Targeting oncogenic K-Ras mutants with a small-molecule degrader through Nedd4-1”的文章，开发了一种能够诱导泛素连接酶Nedd4-1泛素化K-Ras各种致癌突变体蛋白的泛素化与降解，从而抑制携带K-Ras变体的癌细胞的增值与肿瘤发展。本文通讯作者是来自厦门大学生命科学学院的王洪睿教授以及医学院的邓贤明教授。K-Ras突变体一直是癌症治疗的一个难以逾越的障碍。K-Ras作为一种关键的信号分子，在细胞生长和分化中起着至关重要的作用。致癌Ras突变体可以触发下游信号通路的组成型激活，如Raf/MEK/ERK信号转导级联，导致不受控制的细胞增殖、转化、分化和增强的细胞存活。三种Ras亚型（K-Ras、H-Ras、N-Ras）中，癌细胞中K-Ras突变最为频繁。但由于Ras蛋白表面缺少小分子化合物的结合口袋，Ras蛋白长期被认为是不可成药靶点。近年来，研究者们尝试了各种方法希望能够抑制K-Ras活性，例如通过与半胱氨酸形成共价键等。但目前，用小分子药物靶向缺乏特定活性或带电侧基的K-Ras突变体（如K-RasG12V）的活性状态仍然是一个挑战。PROTAC和分子胶降解剂近年来受到广泛的关注，可以诱导E3泛素连接酶与其非天然靶蛋白之间的紧密接近。本文作者之前的研究表明，Nedd4-1蛋白作为所有三种主要形式的Ras（K-Ras、H-Ras和N-Ras）的通用E3泛素连接酶，能够控制其在正常细胞中的丰度。但Nedd4-1能够靶向降解GDP结合的K-Ras，但无法降解GTP结合的K-Ras。在本项工作中，作者开发了一种小分子XMU-MP-9，它能够作为分子胶促进Nedd4-1泛素化和降解各种K-Ras突变体，并抑制携带癌症细胞的K-Ras变体的增殖和肿瘤发展。![]()
在本工作中，作者使用了一个包含4480种小分子的内部化合物库，将4种不同的化合物作为一组，对含Nedd4-1及不含Nedd4-1的细胞系进行了细胞毒性高通量筛选，最终得到能够在含Nedd4-1细胞中杀伤细胞，但对Nedd4-1敲除细胞系没有毒性的分子作为先导化合物。最终得到13种先导化合物，其中一种化合物诱导包含Nedd4-1的细胞而非Nedd4-1-/-细胞中内源性K-RasG12V蛋白水平降低显示出特异性作用，被命名为XMU-MP-9。后续研究表明，XMU-MP-9并不影响K-RasG12V的mRNA水平，且XMU-MP-9对K-RasG12V的降解可以被溶酶体抑制剂氯喹显著阻断，但蛋白酶体抑制剂MG132对其降解并无影响，证明其降解是通过溶酶体途径的。![]()
然后，作者通过体内和体外的方式检测到K-Ras能够以XMU-MP-9小分子剂量依赖的方式被泛素化不同程度。同时，敲除Nedd4-1细胞中，K-Ras的泛素化将被阻断。随后，作者通过体外泛素化位点的质谱鉴定，发现只有K-RasG12V的Lys128位点被检测到。同时作者也发现，只有K128R的点突变消除了XMU-MP-9驱动的K-RasG12V降解。因此，结果表明，XMU-MP-9主要辅助Nedd4-1将泛素附着到K-RasG12V的Lys128位点上。![]()
随后，作者通过MST和CoIP实验验证了XMU-MP-9对K-RasG12V与Nedd4-1之间相互作用的促进作用。发现虽然在XMU-MP-9的作用下，K-RasG12V与Nedd4-1之间的相互作用与没有小分子诱导下差异不大，但CoIP实验能够以小分子浓度依赖的特征增加K-RasG12V与Nedd4-1之间的结合亲和力。作者希望找到SMU-MP-9与Nedd4-1及K-RasG12V的作用位点，以探索其作用模式。作者通过光亲和标记的方法检测到了XMU-MP-9与K-RasG12V及Nedd4-1的临近位点，分别为Nedd4-1的V108、P109和L110以及K-RasG12V的I93、V112和L113。同时，作者也通过点突变实验验证了这些位点信息。![]()
随后，作者针对不同的Ras蛋白进行了降解及其机制验证，类似地，证明了XMU-MP-9通过Nedd4-1和溶酶体依赖的方式降解不同的Ras蛋白。接下来，作者也研究了XMU-MP-9对内源性K-Ras突变体的蛋白质水平和下游信号传导的影响。作者测试了多个不同癌症细胞系，结果显示XMU-MP-9的处理以剂量依赖性地特征诱导这些细胞中内源性K-Ras突变蛋白水平的降低。因此，随着XMU-MP-9诱导的K-Ras蛋白水平的降低，B-Raf和MEK的磷酸化水平显著降低。同时也验证了其对不同人类癌症细胞具有生长抑制作用。![]()
最后，作者评估了XMU-MP-9在体内抑制携带K-Ras的癌症细胞肿瘤生长的功效。通过将SW620细胞皮下注射到裸鼠中，构建成肿瘤模型，然后通过尾静脉注射的方式每日给药。结果显示SMU-MP-9能够以剂量依赖的方式抑制SW620形成的肿瘤的生长。同时也检测到肿瘤组织中K-RasG12V的蛋白水平降低，并B-Raf和MEK的磷酸化水平减弱。总的来说，本文基于已知的Nedd4-1和K-RasG12V的蛋白互作对，通过建库筛选的方法开发出了诱导其相互作用的分子胶，揭示了分子胶技术独特的作用机制及广阔的应用空间。本文作者：LQL
