诱导14-3-3与核转录因子及调节因子相互作用的共价分子胶
文摘
科学
2023-12-07 16:59
北京
最近，加利福尼亚大学的Daniel K. Nomura团队在BioRxiv上发表了一篇关于分子胶筛选的文章，题目为“Covalent 14-3-3 Molecular Glues and Heterobifunctional Molecules Against Nuclear Transcription Factors and Regulators”。本文中，作者通过筛选得到了一个靶向14-3-3蛋白的共价分子胶EN171，它能够共价结合14-3-3，并增强14-3-3与ERα、YAP和TAZ的相互作用，导致ER和Hippo通路转录活性受损。同时还证明了EN171可以用作14-3-3蛋白的异双功能分子的共价配体，将BRD4蛋白拉到细胞质中。14-3-3蛋白能够识别一些含有磷酸化丝氨酸或苏氨酸序列的底物蛋白，例如Raf-1、Bad、Bax、Cdc25、Akt和SOS，以及一些转录因子等，并将它们拉到细胞质中以调控这些底物蛋白的功能。此前有研究表明，一些天然产物，例如fusicoccin A等，能够通过结合稳定14-3-3蛋白与一部分底物蛋白的结合，但不能稳定一些核转录因子如YAP和TAZ等。因此，本文中，作者计划筛选一个共价配体库，来找到14-3-3蛋白的共价配体。作者通过荧光偏振的方法，筛选能够诱导14-3-3蛋白与14-3-3的磷酸化ERα底物稳定结合的小分子。最终筛选得到了小分子EN171，它表现出与阳性对照分子fusicoccin A相同程度的稳定性。同时，作者也发现，EN171也能够稳定14-3-3与YAP和TAZ的结合。接下来，作者通过质谱和点突变的方法，同时合成了EN171的炔烃探针，发现了EN171能够同时共价结合C38和C96两个位点，仅突变其中一个位点并不能阻止其分子胶功能。![]()
（左图为EN171炔烃探针pull-down定量蛋白质组学结果，右图为全蛋白组半胱氨酸反应性组学）接下来，为了鉴定EN171分子的选择性，作者用EN171的炔烃探针处理细胞，利用CuAAC反应在炔烃探针上连接Biotin，并对Pull-down下来的蛋白进行定量蛋白质组。结果显示，有65种蛋白被EN171下调。为了进一步评估细胞内靶标参与和整体选择性，作者进行了基于ABPP的半胱氨酸化学蛋白质组学，描绘了EN171的全蛋白质组半胱氨酸的反应性。结果表明，有46个靶标与EN171具有半胱氨酸反应性。总之，数据表明，EN171以中等程度的选择性结合14-3-3。最后，由于目前靶向14-3-3的化学方法主要集中于14-3-3蛋白的天然底物蛋白上，因此，作者希望测试14-3-3蛋白能否更改非天然底物蛋白的亚细胞定位。作者将EN171与JQ1通过linker连接合成分子QS57，并在HEK293T和T47D细胞中对BRD4的亚细胞定位进行了检测。实验结果显示，QS57处理后，导致细胞核内的BRD4蛋白水平降低，而胞浆种BRD4水平显著增加。而通过shRNA对14-3-3蛋白进行部分敲除后，BRD4亚细胞定位的改变被减弱。而在HCT116细胞系中完全敲出14-3-3蛋白后，BRD4的亚细胞定位不会被QS57分子改变。总之，本文利用荧光偏振的方法筛选得到了一种能够靶向结合14-3-3的共价分子胶，其不仅能稳定14-3-3蛋白与其天然底物蛋白的结合，同时也可以作为异双功能小分子的靶头，诱导14-3-3与非天然底物蛋白相互作用，从而改变其亚细胞定位。本文作者：LQL
