分子胶降解剂是一种能够促进蛋白质泛素化和降解的小分子，包括那些通常被认为是不可降解的蛋白质。与蛋白靶向降解嵌合体(PROTACs)的双功能蛋白降解不同，分子胶降解剂诱导E3泛素连接酶和底物蛋白之间的高亲和力相互作用，而不会对至少一个蛋白显示可检测的亲和力。虽然在PROTACs的合理设计和临床试验方面取得了快速进展，但由于对分子胶降解剂的功能条件和性能了解不足，其开发一直受到阻碍。近日，Ning Zheng和Brian B.Liau团队合作在《bioRxiv》预印本上发表题为“Asymmetric Engagement of Dimeric CRL3KBTBD4 by the Molecular Glue UM171 Licenses Degradation of HDAC1/2 Complexes”研究论文，揭示了分子胶降解剂UM171诱导KBTBD4和HDAC1之间的高亲和力相互作用，促进选定的HDAC1/2协同抑制子复合物的降解。通过描述UM171的直接靶点及其作用机制，揭示了二聚体CRL E3家族提供的协同性如何被小分子降解剂利用并首次建立了双分子胶范式。促进造血干细胞自我更新和扩增的小分子激动剂是基础研究的重要试剂，在基于细胞治疗中具有临床应用1,2。UM171(图1a)最初是在促进HSC扩张分子的表型筛选中发现的3。尽管UM171被广泛使用并进入人体临床试验，但其确切的机制和直接靶点十年来一直没有得到研究。最近，UM171被证明可以通过降解CoREST辅抑制因子复合物的关键亚基来诱导增强子和转录程序的广泛激活。CoREST核心复合体包括赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1a (LSD1)、CoREST和组蛋白去乙酰化酶HDAC1或其类似物HDAC2。在LSD1-HDAC1/2-CoREST (LHC)复合体中，CoREST作为支架在其两端招募LSD1和HDAC1/2。添加UM171后，CoREST泛素化并迅速降解，随后不久LSD1降解，其稳定性依赖于CoREST。为了解开这个谜团，确定 UM171 降解的蛋白质的完整谱系，研究团队在两个 UM171 敏感的白血病细胞系 SET-2 和 MV4;11 中进行了全局蛋白质组学分析，处理或未处理（6 小时，1 µM）后。LSD1 和两个 CoREST 同源物，RCOR1（以下简称 CoREST）和 RCOR3，是 UM171 处理后最显著降解的蛋白质（图1）。RCOR2，另一个 CoREST 同源物，在这两种 AML 细胞系中不表达。其他几个高度下调的蛋白质是更广泛 LHC 复合物的组成部分（例如，RREB1、GSE1、HMG20B、GFI1B），这表明与先前观察到的 HDAC 定向 PROTACs 一样，存在广泛的副作用降解。为了评估哪些下调的蛋白质是 KBTBD4 直接靶点还是副作用靶点，我们使用共免疫沉淀 (co-IP) MS 在 SET-2 细胞中鉴定 LSD1 相互作用的蛋白质，结果表明许多由 UM171 处理降解的蛋白质与 LHC 相关联。值得注意的是，所有三种 CoREST 同源物、MIER1 以及由 UM171 降解程度较低的 MIDEAS 都含有 ELM2-SANT 连接域（图 1）。总而言之，这些结果表明，UM171 促进具有 ELM2-SANT 域的几个核心抑制剂的降解。同时研究者使用荧光降解剂报告系统来定义核心抑制剂中必要的区域，以确定 UM171 诱导降解的区域。在这种系统中，全长或截短的抑制剂变体与 GFP 连接，然后是内部核糖体进入位点 (IRES) 和 mCherry（图1d）。从 CoREST 开始，因为它降解得最有效。虽然删除 N 端 1-100 个氨基酸 (aa) 或 C 端 SANT2 域 (aa 377-482) 对降解影响很小，但删除 aa 1-186 完全阻止了 CoREST-GFP 由 UM171 诱导的降解（图 1e），这提供了 ELM2 域是必要的证据。使用 GFP 报告系统，观察到 ELM2-SANT 域也是 UM171-诱导 MIER1 和 RCOR2 降解所必需的（图 1g）。总而言之，这些结果表明，ELM2-SANT 连接域和HDAC1/2 对于UM171/KBTBD4 介导的选择性核心抑制剂复合物降解至关重要。![]()
图1 UM171诱导的CoREST降解依赖于HDAC1/2相互作用
为了探究 HDAC1/2 在 UM171 降解 CoREST 的作用机制，研究人员构建了 HDAC1 或 HDAC2 敲除的 K562 细胞系，并发现两种酶之间存在功能冗余，但它们的活性是必需的。UM171 与 KBTBD4 和 LHC 形成三元复合物，并且这种复合物在体外介导 LHC 的泛素化。此外，InsP6 在稳定 HDAC1/2 与其配体共抑制剂的相互作用以及形成三元复合物中发挥了关键作用（图2）。![]()
图2 HDAC1介导LHC-UM171-KBTBD4三元复合物的形成
研究者进一步通过cryo-EM分析了与UM171 结合的二聚体 KBTBD4 以及 LSD1-HDAC1-CoREST 复合物。KBTBD4-LHC 复合物采用了一种非对称结构，其中 KBTBD4 同源二聚体的两个亚基，分别称为 KBTBD4-A 和 KBTBD4-B，以双齿方式同时与 HDAC1-CoREST 单份结合（图3a）。在这种非对称组装中，两个 KBTBD4 亚基通过与 HDAC1 的两个不同的界面相互作用：（1）KBTBD4-A 与 HDAC1 催化域的外缘相互作用；（2）KBTBD4-B 通过包裹其活性位点口袋的边缘来夹住 HDAC1。作为 E3-新底物复合物的特征，单个 UM171 分子位于 HDAC1-KBTBD4-B 界面。该化合物的 N-甲基四唑插入去乙酰化酶活性位点口袋的外周，而三环嘧啶并吲哚核心嵌入 KBTBD4-B 诱导的表面沟槽中（图 3a）。通过与 HDAC1 和 KBTBD4-B 的相互作用，UM171 以精致的形状互补性填补了两种蛋白质之间的暴露间隙，从而扩展了蛋白质-蛋白质相互作用界面，充当分子胶水。直接紧邻 UM171 结合位点，InsP6 位于三蛋白交界处，与 HDAC1、CoREST 和 KBTBD4-B 直接接触，以稳定 E3-新底物复合物，充当第二种分子胶水。![]()
图3 KBTBD4-HDAC1-CoREST-UM171复合物的整体结构
KBTBD4 由 BTB 结构域、BACK 结构域和 KELCH 重复螺旋桨结构域组成，并通过 BTB 结构域形成同源二聚体。BTB 结构域 N 端的 b1 螺旋与第二个亚基的 C 端 KELCH 重复螺旋桨形成连接，这在 KBTBD4 中是独特的。KBTBD4 二聚体具有双重对称性，其两个亚基在物理上不接触，而是通过 KELCH 重复结构域的侧面和 β-c 环与 HDAC1 相互作用。从结构结果显示KBTBD4-B 的 KELCH 重复结构域通过与酶的底物结合位点形成广泛的界面来与 HDAC1 发生相互作用，在形成界面中起主要作用。KBTBD4-B 与 HDAC1 的活性位点口袋接触，但其残基没有足够接近活性位点来进入催化口袋。这种非最优的蛋白质-蛋白质界面允许 UM171 插入并补充界面。UM171 通过连接两种蛋白质来稳定 KBTBD4-B-HDAC1 相互作用。在 HDAC1 方面，UM171 将其 N-甲基四唑基团插入酶的活性位点口袋中。UM171 的三环嘧啶并吲哚核心嵌入 KBTBD4-B 的表面沟槽中。UM171 与 HDAC1 和 KBTBD4-B 的相互作用表明，UM171 本身不与 KBTBD4 结合，而是需要 HDAC1 的参与才能与二聚体 E3 相结合（图4）。![]()
图4 UM171起分子胶的作用
进一步研究团队在细胞中系统地突变 HDAC1 和 KBTBD4，并测量其对 UM171 诱导的 CoREST 降解的影响，来测试 cryo-EM 结构中确定的相互作用。他们使用了碱基编辑扫描技术，这是一种可以识别小分子相互作用位点的强大方法。通过这种方法，他们确定了 HDAC1 和 KBTBD4 上与 UM171 结合和复合物形成相关的关键氨基酸残基。这些发现验证了他们之前通过 cryo-EM 结构确定的复合物界面（图5）。![]()
图5 碱基编辑功能绘制KBTBD4-UM171-HDAC1/2界面
总的来说，在这项研究中，其阐明了 UM171 的分子和结构机制，确立了其作为分子胶水的功能。通过与 HDAC1 的活性位点相互作用，UM171 促进形成涉及 LHC、InsP6 和非对称二聚体 KBTBD4 复合物的蛋白质-蛋白质复合物。cryo-EM 结构通过我们的碱基编辑扫描实验得到了功能上的证实，展示了这些方法的优势。分子胶水对内源性蛋白质化学计量学的敏感性突出了使用碱基编辑法绘制小分子相互作用位点的一个强大优势。参考文献：
1. Sakurai, M. et al. Chemically defined cytokine-free expansion of human haematopoietic stem cells. Nature 615, 127–133 (2023).2. Cohen, S. et al. Improved Outcomes of UM171-Expanded Cord Blood TransplantationCompared with Other Graft Sources: Real-World Evidence. Blood Adv. 7, 5717–5726 (2023).3. Fares, I. et al. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell selfrenewal. Science 345, 1509–1512 (2014).本文作者：SY
