通过蛋白降解实现特定组蛋白修饰的下调
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2024-01-05 23:21
北京
近日，来自UNC的Lindsey I. James团队在Journal of the American Chemical Society上发表了一篇题为“Discovery of a Potent and Selective Targeted NSD2 Degrader for the Reduction of H3K36me2”的文章，该工作发现了一个NSD2选择性降解剂，通过NSD2的降解可实现H3K36me2组蛋白修饰的下调。NSD2是一种甲基转移酶，可使组蛋白H3的K36位点带上二甲基化标记，从而激活一些基因的转录。如图1A所示，全长NSD2包含一个“写”H3K36me2标记的催化区域（SET）和多个“读”染色质的区域（2个PWWP结构域和5个PHD结构域）。NSD2也有一些更短的同源异构体。![]()
课题组先前开发了NSD2的PWWP结构域的抑制剂UNC6934（图1C），但该抑制剂不能抑制NSD2的催化活性。NSD2的敲降被证实可以减少H3K36me2修饰。于是，课题组试图在UNC6934的衍生物中寻找NSD2的降解剂。作者选用UBR-box家族的E3酶作为降解NSD2的E3酶。由于UBR-box家族的E3酶通常通过识别特定N端序列起作用，因此课题组想到将UNC6934和基本氨基酸相连来设计NSD2降解剂。根据图1B所示的晶体结构，UNC6934的末端嘧啶环是暴露在溶剂中的，因此推测可以在该嘧啶环上作衍生而不破坏分子与NSD2 的PWWP结构域结合的活性。课题组将UNC6934连接上精氨酸或组氨酸，中间添加不同长度的亚甲基连接，通过表面等离子共振（SPR）实验和胞内western（ICW）实验分别测定各化合物的NSD2亲和力和NSD2降解活性，其中精氨酸衍生物的实验结果如图2所示。![]()
图2
从上述实验结果可以看出，UNC7753的NSD2亲和力和NSD2降解活性都是最好的。通过对UNC7753的精氨酸部分进行改造，课题组合成了一系列UNC7753 的类似物，如图3A、B所示。课题组发现，UNC7996虽然降解NSD2的活性与UNC7753相当，却没有此前认为UBR-box识别N端序列所必需的N端α-氨基；UNC10302685降解活性与UNC7753也相当，却没有此前认为UBR-box结合所需的ε-氮与水分子之间形成的氢键。因此，课题组猜测，可能存在一种与UBR-box E3酶无关的NSD2降解途径![]()
于是，课题组试图寻找可引发NSD2降解的最小药效团。课题组又合成了一系列类似物，其中UNC8153几乎完全失去了精氨酸的官能团，却显示出比UNC7753还强的降解活性。进一步对UBR1、2、3或4进行siRNA敲降的实验证实，UBR-box家族蛋白与UNC7753或UNC8153介导的NSD2降解均无关联，这提示着NSD2的降解可能不是由UBR-box家族的E3酶介导的。通过对细胞处理后打质谱的实验，课题组发现，UNC7753处理的细胞在一段时间后会检测到随时间升高的UNC8153浓度（图3D），因此UNC7753可能是UNC8153的前药。通过对UNC8153及其类似物的降解活性比较（图3E），课题组得出结论：只有UNC8153的一级胺才能推动NSD2的降解。由于钩状效应的存在，课题组推测UNC8153是典型的二价降解剂，即通过同时结合E3和底物发挥降解作用，通过与UNC6934的竞争性抑制实验也证实了这一点（图4A）。为进一步探寻UNC8153降解NSD2的机制，课题组使用典型的蛋白酶体抑制剂MG132干扰降解过程，NSD2的降解确实会被MG132抑制（图4B），证明NSD2确实是通过蛋白酶体途径被降解的。通过NanoBERT泛素化筛选，即在细胞中表达NSD2-NanoLuciferase融合蛋白和HaloTag-Ubiquitin，课题组发现，在UNC8153的处理下，两者结合的BERT信号相比UNC6934处理有所增强。用E1抑制剂TAK243处理，或用Cullin-RING抑制剂MLN4924处理都会抑制NSD2降解，说明NSD2的降解与Cullin-RING家族的E3酶和泛素化降解途径有关。图4C、D显示，UNC8153的效果是快速且持久的。图4E的蛋白组学结果显示，UNC8153降解NSD2的选择性很高。![]()
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下游的组蛋白修饰检测结果显示，UNC8153对组蛋白修饰H3K36me2有明显下调作用（图5）。进一步的功能研究显示，UNC8153对肿瘤的抑制效果随着细胞的基因型不同而变化（图6）。对于携带NSD2 E1099K高突变的MM1S细胞，UNC8153显示出轻微的抗增殖作用，但在其他没有发生NSD2突变的癌细胞系中，UNC8153虽然可降解NSD2水平，但不能显著改变增殖活力。本工作是一项对NSD2降解剂的降解活性、降解机制、细胞作用的研究，课题组发现了有效的NSD2降解剂UNC8153，并初步研究了其降解NSD2的机制，验证了UNC8153对NSD2介导的组蛋白修饰H3K36me2的抑制作用，以及初步证实了其对NSD2突变的癌细胞的抑制作用。该研究显示出NSD2是抗肿瘤领域的潜在靶点，且蛋白降解剂对于攻克该靶点相关的肿瘤疾病有着应用潜力。本文作者：FM
