近日，来自Scripps研究所的Benjamin F. Cravatt教授、Bruno Melillo教授和来自哈佛大学的Ramnik J. Xavier教授、Stuart L. Schreiber教授在bioRxiv上发表了一篇题为《Chemical tools to expand the ligandable proteome: diversity-oriented synthesis-based photoreactive stereoprobes》的文章。他们利用化学工具扩展可结合蛋白质组的多样性，通过基于多样性导向合成（DOS）的方法生成光反应性立体探针。这些探针包含二氮烯和炔基，用于紫外线诱导的共价修饰和点击化学富集相互作用的蛋白质。文章介绍了这些探针与人类细胞中数百种蛋白质的立体选择性相互作用，并展示了这些相互作用可以形成高通量筛选兼容的nanoBRET检测的基础。通过综合表型分析和化学蛋白质组学，发现了能够通过结合线粒体丝氨酸蛋白酶CLPP调节自噬的探针。![]()
图1 (A)光反应性立体探针的结构。(B)立体探针-蛋白质相互作用的凝胶分析
作者首先用凝胶电泳分析了立体探针在人体细胞（Ramos或22Rv1细胞）中的蛋白质相互作用。这些细胞与立体探针（20 µM）共同孵育30分钟，然后进行10分钟的紫外线交联。可溶性部分中的立体探针修饰蛋白质通过CuAAC反应与四甲基罗丹明-叠氮（TAMRA-N3）报告标签结合，随后进行SDS-PAGE和凝胶内荧光扫描。红色星号标记显示了由立体探针进行立体选择性标记的蛋白质。这些探针在紫外线诱导下能够共价修饰并点击化学富集与目标蛋白质的相互作用，最终通过凝胶分析和荧光扫描确认这些相互作用的立体选择性。![]()
图2 基于质谱的光反应性立体探针-蛋白质相互作用在人体细胞中的蛋白质组学分析。
随后作者进行了基于质谱（MS）的光反应性立体探针在人体细胞中蛋白质相互作用的蛋白质组学分析。质谱分析工作流程使用串联质谱标签（TMT）进行多重化分析，以量化不同立体异构探针的蛋白质富集情况。通过象限图展示了色氨酸、氮杂环丁烷和吡咯烷探针在Ramos细胞中的立体选择性结合蛋白质，x轴表示立体异构体对某种蛋白质的最大结合比例（enantio-ratio），y轴表示探针与其对映体相比的富集比例（diastereo-ratio）。颜色标记显示具有显著立体选择性结合的蛋白质，深色表示同时具有较高的enantio-ratio和diastereo-ratio，浅色表示只有较高的enantio-ratio。综上，通过质谱分析作者揭示了光反应性立体探针在蛋白质组学研究中的应用潜力和立体选择性特征![]()
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图3 光反应性立体探针立体选择性结合蛋白质的特征分析
然后作者研究了光反应性立体探针立体选择性结合蛋白质的特征。通过化学蛋白质组学和表型筛选分析了这些探针在人体细胞中的应用。蛋白质结合特征的全局映射展示了光反应性立体探针在人体癌细胞中与超过200种结构和功能各异的蛋白质的立体选择性结合情况。这些蛋白质包括难以开发化学探针的类别，如适配蛋白/支架蛋白和转录调控蛋白。探针-蛋白质相互作用显示了对细胞环境的可变依赖性，有些相互作用仅在原位发生而在体外不发生，而有些则不能在重组表达的蛋白质中再现，这与大型蛋白质复合物的成员身份相关。竞争实验表明，光反应性立体探针通常与蛋白质的结合亲和力较低，但这些探针仍可作为高通量筛选兼容的靶点结合检测的基础。例如，DBK-032A与IPO9的高亲和力相互作用通过竞争性抑制实验得到验证。利用表型筛选发现了通过与线粒体丝氨酸蛋白酶CLPP结合来调节自噬的探针。这些化合物被推测为CLPP抑制剂，但还需进一步研究以理解其具体作用机制。![]()
图4 光反应性立体探针立体选择性结合蛋白质的特征描述。
作者随后确认了在原位条件下光反应性立体探针与RNF14 (A)、YKT6 (B)和SET (C)蛋白质的立体选择性结合。同时实验结果表明CLPP蛋白质仅在原位条件下与光反应性立体探针DBK-032A的立体选择性结合，而在体外条件下未显示出这种结合。图E表明在重组形式下未能展示立体选择性结合的蛋白质在BioPlex相互作用数据库中显示出较高的相互作用次数。图F表明SAE1蛋白质与光反应性立体探针DBK-032A的立体选择性结合需要SAE1互作蛋白SAE2 (或UBA2)的存在。进一步通过相对富集谱图和凝胶分析验证了这些光反应性立体探针与蛋白质的相互作用，支持了光反应性立体探针在扩展可结合蛋白质组中的应用潜力。![]()
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图5 评估细胞裂解液中立体探针-蛋白质相互作用的化学计量比。
作者评估了光反应性立体探针-蛋白质相互作用在细胞裂解液中的化学计量比。使用非光反应性的丙酰胺类似物进行竞争实验，以评估光反应性立体探针与蛋白质的结合亲和力。实验中使用了DBK-073A和DBK-073B作为竞争抑制剂，测试其对光反应性立体探针DBK-032A和DBK-032B与蛋白质相互作用的阻断效果。在细胞裂解液中进行的初步竞争实验表明，大多数光反应性立体探针-蛋白质相互作用具有低亲和力。但是，IPO9蛋白质与DBK-032A的相互作用显示出较高的亲和力，DBK-073A对DBK-032A与IPO9相互作用的阻断效果优于其对映体DBK-073B，IC50值约为2.6 µM。在原位实验中也观察到了DBK-073A对DBK-032A与IPO9相互作用的立体选择性竞争效果，进一步确认了IPO9作为高亲和力结合靶点的特性。总的来说，大多数相互作用具有低亲和力，但也识别出了如IPO9这样的高亲和力靶点![]()
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图6 将光反应性立体探针-蛋白质相互作用转化为高通量筛选兼容的nanoBRET检测方法。
作者利用nanoBRET检测方法，将光反应性立体探针-蛋白质相互作用转化为高通量筛选兼容的检测方法，为后续的药物开发和生物研究提供了新的工具和方法。进一步展示了其探针的兼容性和实用性。![]()
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图7 综合表型筛选和化学蛋白质组学鉴定出通过结合CLPP来调节自噬的光反应性立体探针。
作者使用LC3斑点诱导分析作为自噬体形成的指示，通过荧光显微镜量化HeLa细胞中LC3斑点的形成。发现一种光反应性立体探针DBK-032A能够以立体选择性方式促进LC3斑点的形成，并具有浓度依赖性，EC50为3.7 µM。通过LC3-II免疫印迹分析进一步确认了DBK-032A对自噬通量的影响，显示出立体选择性增加LC3-I向LC3-II的转化。随后进行了一系列DBK-032A的结构类似物分析，确定了对LC3斑点形成具有相似（如WX-02-22）或减弱（如WX-03-97）活性的化合物。通过质谱分析鉴定了DBK-032A相对于其对映体DBK-032B和其他无活性类似物特异性富集的蛋白质。识别出五种特异性富集的蛋白质，包括CLPP、IPO9、SAE1、EMC6和PIR。通过基因敲低和基因敲除实验评估了CLPP和IPO9在自噬中的生物学相关性。发现CLPP的敲低或敲除显著促进了HeLa细胞中的基础LC3斑点形成活性，而IPO9没有这种效果。综上所述，这篇文章展示了基于多样性导向合成的光反应性立体探针在蛋白质组学研究中的重要应用。通过质谱和表型筛选等多种方法，揭示了这些探针与多种蛋白质的立体选择性相互作用，并证明了它们在高通量筛选中的潜力。特别是，研究识别出了一些能够调节自噬的探针，如DBK-032A，通过结合CLPP实现其功能。这些发现为小分子探针的开发和蛋白质相互作用的研究提供了新的工具和方法。
