通过同基因形态分析发现分子胶降解剂
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2023-12-13 15:46
北京
靶向蛋白质降解药物主要有两类：蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC) 和分子胶降解剂 (MGD)。与 PROTAC 相比，MGD 由于其分子机制而具有更广泛的潜在靶点空间。MGD 诱导 E3 连接酶和靶标之间的协同相互作用。MGD 的吸引力导致了各种筛查方法的发展。例如，转录组学和药物反应（癌细胞系的药物敏感性）资源的数据挖掘已导致非降解分子胶和 MGD 的鉴定。由于这些分析使用多个细胞系，因此可以探索广泛的基本目标。鉴于所需的密集资源，这些分析通常是回顾性进行的，因此排除了对定制化学库的分析。还开发了利用细胞活力读数的靶标不可知的初级测定。这些检测方法占用的资源较少，并且可以使用定制的化学库，但仍仅限于必需的靶蛋白。解决这一限制的一个有吸引力的策略是采用形态学分析方法来发现 MGD。近日，Georg E. Winter团队在ACS. Chem. Biology上发表了题为Discovery of Molecular Glue Degraders via Isogenic Morphological Profiling的研究论文，其团队进行了概念性验证，采用同基因细胞涂色测定 (CPA) 和相关的计算方法来发现将 CRBN（CUL4 CRBN E3 连接酶复合物的底物受体）选为 TPD 的MGD。为了测试同基因 CPA，筛选了 132 种 CRBN 结合剂的库，该库基于开发的硫 (VI) 氟化物交换 (SuFEx) 化学的高通量合成方案合成的。这种点击化学的新模式基于用合适的亲核试剂取代 S(VI)-F，形成稳定的化学连接。与传统的铜催化叠氮化物-炔环加成 (CuAAC) 不同，SuFEx 反应在无金属条件下发生，使其成为后续基于细胞的高通量测定（“直接生物学”(D2B)）的理想选择。使用此工作流程，该团队发现并表征了一种结构新颖的 GSPT2 降解剂。研究者通过重点关注经过临床验证的 E3 连接酶 CRBN 来测试同基因 CPA 概念。与其他 E3 连接酶相比，CRBN 拥有最多数量的已报道的针对各种蛋白质的 MGD 和异双功能降解剂（<50 个独特目标），可以将其用作同基因 CPA 的 CRBN 依赖性对照。CRBN 在其目标上有一个被称为 G 环的允许识别基序。计算挖掘尝试估计有 600 到 2500 多种独特蛋白质含有 G 环，因此，这可能为发现具有新靶点的 MGD 提供了广泛的机会。该研究团队使用RKO结直肠癌细胞系进行研究。在该细胞系中含有G环的蛋白质一半不表达，表达的一般主要包含非必须蛋白（49.6%），只有6.6%为必须蛋白质。这凸显了需要MGD 发现方法超越了细胞活力读数的范围。研究者利用SuFEx 反应，这是一种高效的点击化学反应，使其成为化合物库高通量合成的理想选择。使用该方案，能够在 384 孔板中快速合成 132 种化合物的库，可直接用于生物测定。为了告知 CPA 中该库的使用情况并对其进行基准测试，该团队还选择了九种依赖于 CRBN 的双功能降解剂和 MGD 以及六种不依赖于 CRBN 的化合物作为对照。同时还纳入了甲基化泊马度胺（缺乏 CRBN 结合亲和力）和八种已知可诱导多种形态变化的化合物（称为“形态对照”）。对于同基因 CPA，使用表达不同水平 CRBN 的三种同基因细胞系：RKO WT、CRBN 敲除的 RKO (RKO CRBN KO) 和 CRBN 重构的 RKO CRBN KO (RKO CRBN OE)。首先接种细胞，然后用化合物处理48 小时。最后，我们对细胞进行染色和固定，并从板上获取图像。然后从这些图像中收集形态特征。研究者观察到，一些 CRBN 依赖性降解剂，如泊马度胺，形态扰动强度较低，而其他降解剂，如 TL 13-12（CRBN 依赖性多激酶 PROTAC具有较高的形态扰动强度。正如二维均匀流形近似和投影 (UMAP) 投影所示，许多化合物在可能的细胞形态的有限范围内引起微妙的形态变化，只有少数化合物会产生强烈且独特的形态（图2）。研究团队首先使用TL 13-12 对该工作流程进行基准测试。他们观察到 TL 13-12 在 RKO CRBN KO 和 RKO CRBN OE 环境之间诱导明显的形态变化。最值得注意的是，TL 13-12 诱导了 RKO CRBN OE 的急剧扩张，而 RKO CRBN KO 的大小几乎没有变化。RKO CRBN OE 计算的诱导分数显着高于 RKO CRBN KO 的诱导分数。最终校正的U分数为 0.999，可以自信地预测 TL 13-12 是一种具有 CRBN 依赖性生物活性的化合物。将该程序扩展到所有其他化合物，我们观察到报告的 CRBN 依赖性在我们的控制中的区别。值得注意的是，所有依赖 CRBN 的阳性对照均将U分数校正至 0.7 以上。因此，决定将实验确定的 0.7 阈值应用于预测为 CRBN 依赖性的化合物。根据摸索的标准选择FL2-14进行靶标阐明。首先，FL2-14与所有依赖 CRBN 的对照具有较低的余弦相似性（即，没有粗的蓝色边缘）。其次，它与沙利度胺具有相当的 CRBN 结合亲和力，证实了足够的 E3 连接酶募集。第三，它具有独特的化学结构，是唯一一种尾部基团修饰14预计具有 CRBN 依赖性生物活性的 CRBN 结合剂。为了阐明FL2-14的靶标，我们进行了定量蛋白质组学，以评估FL2-14处理后蛋白质丰度的变化。对超过 8000 种蛋白质进行了定量，其中 3 种蛋白质显着下调，即 GSPT2、FAM83F 和 ZBTB39（图3）。FL2-14的下调靶点与两个 CRBN 依赖性对照（CC-885 和泊马度胺）存在部分重叠。CC-885 会降低 GSPT1 和 GSPT2 等目标。尽管 GSPT1 和 GSPT2 是同源蛋白，但 GSPT1 是泛必需的，而 GSPT2 在 1095 个分析的细胞系中都不是必需的。总的来说，课题组开发的同基因 CPA 和计算分析方法将有助于 MGD 发现。期望所开发的同基因 CPA 背后的逻辑适用于所有其他 E3 连接酶，这些连接酶在给定的细胞背景下容易获得和丧失功能突变。本文作者：SY
