目前使用的大多数获批抗病毒药物都是小分子，它们可以结合并干扰必需病毒蛋白（在大多数情况下是病毒酶（例如病毒聚合酶、蛋白酶））的功能。这些直接作用的抗病毒药物 (DAA) 在联合使用时非常有效，可以治愈丙型肝炎病毒 (HCV) 并长期控制人类免疫缺陷病毒 (HIV)。尽管取得了这些成功，但 DAA 抑制剂通常存在窄谱活性（“一种病毒，一种药物”）的问题，资源限制对开发针对其他生物医学关注的病毒病原体的等效 DAA 构成了重大挑战。RNA 病毒产生遗传多样性的能力也是抗病毒药物耐药性的主要驱动因素，因为天然耐药变异体可能在治疗开始前就已存在，并在治疗开始时出现，正如使用单个 DAA 作为 HIV1、 HCV2和IAV3,4的单一疗法所观察到的那样，并且因为降低药物敏感性的突变可以在抗病毒单一疗法治疗期间通过低水平复制产生。需要采用系统方法来提高效力并扩大相关病毒种类的疗效。
近日，Priscilla L. Yang和Nathanael S. Gray团队合作在Nature communications上发表题为“Broad-spectrum activity against mosquito-borne flaviviruses achieved by a targeted protein degradation mechanism”研究论文，报道了通过将已知的 E 融合抑制剂与 CRL4 CRBN E3泛素连接酶的配体偶联，开发出针对登革热病毒包膜 (E) 蛋白的蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC)。产生的小分子通过抑制 E 介导的膜融合阻止病毒进入，并通过消耗受感染的 Huh 7.5 细胞中的细胞内 E 来干扰病毒颗粒的产生。在点突变存在的情况下，这种活性得以保留，此前已证明点突变会因抑制剂结合减少而对亲本抑制剂产生部分耐药性。与亲本 E 抑制剂相比，E PROTAC 还表现出针对一组蚊媒黄病毒的更广的活性谱。这些发现鼓励进一步探索靶向蛋白质降解作为开发广谱直接作用抗病毒药物的差异化和潜在有利的方式。黄病毒属是一种通过节肢动物媒介传播的正链 RNA 病毒。登革热病毒 (DENV) 目前传播最为广泛，每年有超过 4 亿人感染。该属中其他引起人类疾病的蚊媒成员包括寨卡病毒 (ZIKV)、日本脑炎病毒 (JEV)、西尼罗河病毒 (WNV) 和黄热病病毒 (YFV)。由于气候变化和全球化，这些病毒预计将继续传播。尽管黄病毒是全球主要的健康威胁，但有效的 DAA 和基于疫苗的策略仍然是尚未满足的主要生物医学需求。由于针对该病毒组所有单个成员的 DAA 的开发资源有限，因此，能够有效对抗多种黄病毒物种的广谱 DAA 的可用性将代表该领域的重大突破。黄病毒包膜 (E) 蛋白以90个融合前二聚体的形式存在于病毒体表面，对病毒复制周期的多个步骤至关重要。首先，它通过其结构域 III 与质膜细胞外侧的宿主因子相互作用，介导病毒进入的初始附着步骤。在通过网格蛋白依赖性内吞作用将病毒体内化后，内体区室的酸化会触发 E 重组和重新折叠为融合后三聚体。这些显著的结构变化为病毒脂质双层与内体膜融合提供了驱动力，从而形成了一个融合孔，使病毒基因组能够逃逸到细胞质中，在那里可以表达。E蛋白在复制周期的后期阶段也至关重要，因为如果没有E，就不会产生新的传染性病毒体。诱变研究已发现点突变会影响进入或病毒颗粒的产生，以及影响这两个过程的突变，这表明针对E的小分子可能通过一种或多种作用方式发挥作用。去污剂 n-辛基-β-D-葡萄糖苷 (βOG) 在位于结构域 I 和 II 之间的保守口袋 (称为“βOG 口袋”) 中的偶然共结晶促进了 DENV E 介导的融合的小分子抑制剂的开发(图1A ) ，其中负责改变相关黄病毒融合的 pH 阈值的残基之前已被鉴定。这种高分辨率共晶体结构的可用性以及用于监测E在膜融合中的生化功能的检测方法使研究者们能够发现和优化多个系列的小分子，这些小分子与融合前的DENV E结合，并通过抑制病毒进入过程中的融合发挥抗病毒活性。通过结合 E 来开发抑制病毒体产生的小分子的途径不太明显。在新形成的未成熟病毒体上，E 与其病毒伴侣 prM 结合，并以 60 个三聚体刺突的形式存在，每个刺突包含三个 prM-E 异二聚体( ( prM/E) 3 )。成熟和未成熟病毒体上结构域 I 和 II 的位置差异会显著影响 βOG 口袋（图1B）。当未成熟病毒体通过分泌系统时，它们会经历成熟过程，最终在细胞外空间释放出带有特征性的 90 个 E 融合前二聚体的成熟病毒体。虽然这些结构变化已被很好地描述，但尚未确定使用小分子干扰这一过程的方法。此外，抗prM抗体能够介导完全未成熟的病毒颗粒的感染，这表明在病毒成熟过程中阻止 E 的结构变化可能不会产生预期的抗病毒效果。另一种方法可能是在新颗粒形成之前针对 E；然而，病毒出芽前的 E 结构以及与小分子的相互作用是否可以抑制病毒的形成尚不清楚。![]()
图1 针对DENV E蛋白的双价降解剂的设计
为了设计针对 DENV E 蛋白的 PROTAC，研究者们从两个结构独立的先导系列中选择了特征明确的 E 融合抑制剂作为 E 靶向配体。GNF-2（4,6-二取代的嘧啶）和 2-12-2（2,4-二氨基取代的嘧啶）（图 1C）先前已显示可与成熟 DENV 病毒体表面的融合前 E结合，并通过抑制 E 介导的膜融合来阻止感染。尽管这些分子与 DENV E 蛋白结合的高分辨率结构尚未解决，但研究者们利用了先前定点诱变和药物化学研究中的见解来指导PROTAC 设计并以一种避免对与 E 的相互作用产生有害影响的方式连接接头，并且应该能够有效地募集 E3 连接酶。为了招募 E3 连接酶，研究者们选择了 CRBN 的配体，CRBN 是 CRL4 CRBN E3 泛素连接酶的底物识别亚基。开发这些 PROTAC 所需的药物化学工作，包括 DC 50和 DC max测定以及降解剂特异性的蛋白质组学评估。这些导致鉴定出两种降解剂候选物 ZXH-2-107 和 ZXH-8-004，分别源自 GNF-2 和 2-12-2，为简单起见，以下将分别称为“GNF-2-deg”和“2-12-2-deg”（图 1D）。为了区分 GNF-2-deg 和 2-12-2-deg 的抑制依赖性和降解依赖性药理学，研究者们合成了相应的阴性对照化合物 GNF-2-deg-BUMP 和 2-12-2-deg-BUMP（图1D），通过用δ-内酰胺部分替换沙利度胺上的戊二酰亚胺环，大大减少了与 CRBN的相互作用，这已得到实验证实。为了验证 GNF-2-deg 和 2-12-2-deg 在病毒感染的情况下起到 E 降解剂的作用，研究者们首先表征了它们对 DENV2 感染细胞中 E 细胞内丰度的影响，如图 2A 所示。GNF -2-deg (DC 50 0.83 μM，DC max 99%) 和 2-12-2-deg (DC 50 0.21 μM，DC max 95%)均导致细胞内 E 蛋白的浓度依赖性减少。E的这种影响是 CRBN 依赖的，因为在阴性对照化合物 GNF-2-deg-BUMP 和 2-12-2-deg-BUMP 中或在 CRBN 缺陷细胞 (CRBN −/− )中进行感染时未观察到这种影响(图2B )。同样，在存在 neddylation 抑制剂 MLN4924 或蛋白酶体抑制剂 MG-132 的情况下，或当存在过量的来那度胺与 E 降解剂竞争结合 CRBN 时，GNF-2-deg 和 2-12-2-deg 不会消耗 E (图2C-F )。总之，这些实验支持以下解释：GNF-2-deg 和 2-12-2-deg 在病毒感染的细胞中充当 DENV E 的真正降解剂。![]()
图2 GNF-2-deg 和 2-12-2-deg 诱导受感染细胞中 CRBN 和蛋白酶体依赖性的 DENV E 耗竭
为了确定 GNF-2-deg 和 2-12-2-deg 消耗 E 是否会产生显著的抗病毒活性，他们检查了它们对细胞培养中活体 DENV2 复制的影响，如图 2A所示。两种 E 降解剂在没有明显细胞毒性的情况下导致病毒产量显著浓度依赖性降低（图 3A）。有趣的是，与各自的亲本抑制剂相比，GNF-2-deg 和 2-12-2-deg 的抗病毒活性显著提高，GNF-2-deg 的抗病毒 EC 90 WT值为 3.50 ± 1.52 μM，而 GNF-2 的 EC 90 WT值为 13.11 ± 3.59 μM，2-12-2-deg 的 EC 90 WT为1.67 ± 0.71 μM，而 2-12-2 的 EC 90 WT为13.27 ± 0.05 μM（图 3A）。这种抗病毒活性的改善依赖于 CRBN，因为在 GNF-2-deg-BUMP 和 2-12-2-deg-BUMP 中或在 CRBN −/−细胞中测试 GNF-2-deg 和 2-12-2-deg 时均未观察到这种改善。此外，观察到在 E 降解剂存在的情况下，使用抑制 neddylation（MLN4924）或蛋白酶体活性（MG-132）或阻止 CRL4 CRBN接合（过量来那度胺）的化合物联合处理至少部分挽救了 DENV 复制，而在亲本 E 抑制剂存在的情况下，这些处理对 DENV 复制的影响可以忽略不计（图3B-D）。综合起来，结果提供了强有力的证据，表明 GNF-2-deg 和 2-12-2-deg 利用 CRL4 CRBN E3 连接酶消耗细胞内 DENV E 蛋白，并且这种抗病毒活性与抗病毒效力的显著增强有关。![]()
图3 GNF-2-deg 和 2-12-2-deg 具有 CRBN 和蛋白酶体依赖性的抗 DENV 抗病毒活性
为了更直接地研究化合物对病毒颗粒产生的影响，研究者们使用了病毒样颗粒 (VLP) 模型系统，该系统可以在没有病毒进入、多蛋白表达和加工以及基因组复制的情况下研究 DENV 颗粒的产生。在这些实验中，在用prM -E 表达质粒转染后 4小时添加 E 抑制剂和 E 降解剂均导致 WT 细胞内 E 和分泌的 VLP 显着减少（图4A）。融合抑制剂 GNF-2 和 2-12-2 对黄病毒颗粒产生的影响是意料之外的，因为研究者们和其他人之前都没有报道过这种活性。虽然研究者们还不知道在这个实验模型中抑制剂存在下 E 消耗的潜在机制，但它似乎与 E 降解剂的机制不同。值得注意的是，尽管 GNF-2 和 2-12-2 的活性在 WT 和 CRBN −/−细胞中相同，但 GNF-2-deg 和 2-12-2-deg 的活性在 CRBN −/−细胞中不存在。这与 GNF-2-deg 和 2-12-2-deg 通过 CRBN 依赖的 TPD 机制影响 DENV 病毒颗粒产生的想法一致。尽管亲本抑制剂 GNF-2 和 2-12-2 是 DENV 融合前 E 的已验证配体，但由于未成熟和成熟病毒体表面上结构域 I 和 II 的方向不同，它们在 βOG 口袋中的结合位点并不存在于未成熟病毒体上（图1B、4B-C）。GNF-2-deg 和 2-12-2-deg 引起的 CRBN 依赖性细胞内 E 耗竭表明 βOG 口袋在裂解前存在于多聚蛋白中，或在 E 从多聚蛋白上裂解后但在病毒出芽前存在于 E 中。尽管从形式上看，GNF-2-deg 和 2-12-2-deg 在 VLP 系统中的作用可能是通过降解或抑制脱靶而不是由于 E 的结合介导的，但用于分析 GNF-2-deg 和 2-12-2-deg 降解剂特异性的蛋白质组学实验并未发现任何预计会影响黄病毒颗粒产生的细胞靶标。为了更明确地测试 GNF-2-deg 和 2-12-2-deg 对 VLP 产生的活性是否归因于 E 的结合，研究者们生产了带有 βOG 口袋突变的 VLP。当 DENV2 在化合物 7-148-6（2-12-2 的类似物）存在下连续传代时，发现了位于 β 链 f 基部的 E-M196V 突变。这种取代之前已被证实可赋予对 7-148-6 和相关 GNF-2 类似物的部分抗性，并使可溶性融合前 E (sE 2 ) 与 2-12-2 的结合降低 3 倍以上，与 GNF-2 的结合降低 10 倍以上。取代 E-F193L 和 E-F279S 也在定点诱变研究中被表征，并被证明可使 sE 2与 2-12-2、GNF-2 以及相关的 2,4-二氨基嘧啶和 4,6-二取代嘧啶 E 融合抑制剂的结合降低 3 至 10 倍以上。研究者们检查了这些取代是否影响 GNF-2-deg 和 2-12-2-deg 对细胞内 E 丰度和 VLP 产生的活性（图 4D）。在对应于活病毒测定中测得的 抗病毒 EC 90值的单一浓度下，E 降解剂对细胞内 E 丰度和分泌的 VLP 的影响对于 WT 和单一突变（E-F193L、E-M196V 和 E-F279S）VLP 相当（图4A、D）。然而重要的是，两种 E 降解剂均未对 E-F193L/M196V 双突变体表现出影响（图 4D）。这支持了 GNF-2-deg 和 2-12-2-deg 通过与 E 结合对 VLP 产生影响的想法，并且与 E PROTAC 对降低化合物结合的单个突变的影响小于亲本抑制剂的想法一致。![]()
图4 GNF-2-deg 和 2-12-2-deg 通过 TPD 机制抑制病毒颗粒的产生
在之前将 GNF-2 和 2-12-2 表征为病毒进入过程中融合的抑制剂时，研究者们发现这两种化合物都能抑制所有四种 DENV 血清型的进入（EC 90值在个位数微摩尔内），而对其他蚊媒黄病毒（JEV、WNV Kunjin）的活性则较为温和。这项先前的工作利用了感染性测定，其中抗病毒活性仅限于对病毒进入过程中 E 介导的融合的影响，通过在最初一小时感染期后洗脱化合物和/或使用不能产生新病毒颗粒的单周期报告病毒。为了检查将 GNF-2 和 2-12-2 转化为基于 TPD 机制的 GNF-2-deg 和 2-12-2-deg 是否会产生更广谱的活性，研究者们比较了两种母体抑制剂和两种降解剂对 ZIKV、JEV、WNV Kunjin 和 YFV 的抗病毒活性，在这些条件下，这些化合物存在于病毒的整个生命周期中，以捕捉由于两种作用模式（进入和颗粒生成）而产生的抗病毒活性。在这些实验中，GNF-2 和 2-12-2 的抗病毒效力高于研究者们之前观察到的，这与母体抑制剂也能影响进入和颗粒生成的观察结果一致；然而，GNF-2-deg 和 2-12-2-deg 表现出比其各自的亲本抑制剂更强的抗病毒效力，对 ZIKV、JEV 和 WNV Kunjin 的抗病毒 EC 90值始终以个位数微摩尔为单位，并且 GNF-2-deg 对 YFV 的活性也有所提高（图 5）。![]()
图5 与亲本 E 抑制剂相比，E 降解剂表现出更强的抗病毒效力和更广谱的抗病毒活性
总的来说，这些结果表明黄病毒 E 蛋白的 βOG 口袋是一个分子靶点，可以通过两种不同的作用方式介导抗病毒活性，并表明这种双重作用模式可以使 E 抑制剂和 E PROTAC 具有更强的抗病毒活性。这项工作表明，抗病毒活性可以通过降解非酶病毒蛋白来实现，从而为靶向病毒酶之外的其他研究提供了机会，并强调 E 降解剂有可能在病毒属的多个成员中实现广谱活性。参考文献：
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本文作者：SY
