近日，由美国德克萨斯大学圣安东尼奥健康科学中心生物化学与结构生物学系和格里希儿童癌症研究所的研究团队在Nature Communications期刊发表了题为“Development and crystal structures of a potent second-generation dual degrader of BCL-2 and BCL-xL”的文章。该研究基于前期工作开发了针对BCL-2和BCL-xL的第二代双降解剂，并解析了相关的分子机制。
BCL-2蛋白家族的成员是细胞凋亡的关键调节因子，包括抗凋亡（BCL-2、BCL-xL、MCL-1等）和促凋亡（BAD、BIM、PUMA、BAK、BAX等）蛋白。抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的相对丰度控制着细胞命运并维持体内平衡。在肿瘤发生过程中，癌细胞通过过表达抗凋亡蛋白来逃避细胞凋亡，从而帮助肿瘤发生、进展和耐药性的发展。因此，作为癌症治疗的策略，人们一直关注开发针对BCL2蛋白家族的小分子抑制剂和降解剂。2021年该团队在Nature Communications发表了针对BCL-xL和BCL-2的双降解剂753b，但该PROTAC涉及的特异性分子机制仍然未知。
在这项研究中，作者确定了753b介导BCL-xL/BCL-2靶向降解的分子基础，并解析了VHL/753b/BCL-xL和VHL/753b/BCL-2三元配合物的晶体结构。而且作者发现这两种三元复合物表现出明显不同的结构，在VHL/753b连接子/靶标界面上展现不同的相互作用网络。更进一步，作者基于结构开发出了降解BCL-xL/BCL-2更强效力的降解子WH244，并解析了VHL/WH244/BCL-2的晶体结构和阐明了其提高有效性的潜在机制。
首先，为最大限度地提高获得衍射质量晶体的概率，作者优化了一种获得纯三元配合物的生化复溶策略，将蛋白质和753b混合物使用凝胶过滤柱进一步纯化，对均相三元配合峰进行汇集、浓缩和结晶试验。经过大量优化，获得了VCB/753b/BCL-2（以下简称BCL-2753b）和VCB/753b/BCL-xL（以下简称BCL-xL753b）的三元配合物结构。最终的BCL-2753b和BCLxL753b结构在2.56 Å和2.94 Å分辨率下分离，R/Rfree值分别为0.20/0.25和0.20/0.24（图1）。
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为了评估WH244和753b诱导的BCL-xL和BCL-2的降解效率，作者还通过CRISPR Cas9技术生成了内源性HiBiT敲入BCL-xL和HiBiT敲入BCL-2的HeLa细胞。进一步在编辑的细胞中进行了时间过程测定，确认WH244诱导的BCL-xL和BCL-2降解速度快于753b。为进一步评估753b和WH244对BCL-xL/BCL-2蛋白的细胞选择性，作者进行了多重串联质谱（TMT）标记质谱蛋白质组学实验和不同的蛋白质组学分析技术（即数据独立采集（DIA）蛋白质组学方法）来表征BCL-xL和BCL-2双PROTAC的靶向和脱靶效应，发现753b和WH244都显示出降解BCL-xL和BCL-2的能力，其中WH244在降解这两种蛋白质方面表现出卓越的功效。作者最后通过AlphaLISA和NanoBRET进行了体外三元复合物形成测定，观察到与753b相比，BCL-xL和BCL-2都与WH244形成了更紧密的复合物（图4）。
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本文作者：BC
