双功能小分子调控靶蛋白O-GlcNAc的糖基化后修饰
文摘
科技
2024-04-12 12:07
北京
近期，香港中文大学的吴维龙教授课题组在Journal of the American Chemical Society上发表了一篇题为“Targeted Protein O‑GlcNAcylation Using Bifunctional Small Molecules”的工作。在该工作中，他们开发了一种OGTACs（O-GlcNAcylation TArgeting Chimeras）技术，其能够在活细胞内特异性调控靶蛋白O‑GlcNAcylation的糖基化后修饰。O‑GlcNAcylation在转录、代谢、细胞信号转导、蛋白稳定性和核质转运等方面发挥重要的调控作用。O‑GlcNAcylation的异常会导致癌症、神经退行性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病和糖尿病等多种疾病的产生。现有技术在动态调控特定靶蛋白的O‑GlcNAcylation上均存在局限性，因此该课题组开发了OGTACs，通过一个异双功能小分子拉近OGT和POI，进而诱导特定靶蛋白的O‑GlcNAcylation。由于OGT缺少非抑制活性的配体，因此他们在该工作中使用了常见的tag系统。他们构建了FKBP12F36V-OGT（fOGT）的融合蛋白，同时将待调控的靶蛋白与HaloTag融合，通过由AP1867、Linker、卤代烷三部分组成的异双功能小分子调控靶蛋白的O‑GlcNAcylation（图1 A, B）。他们首先用BRD4进行概念验证。他们摸索了HaloTag-BRD4（HTN-BRD4）和fOGT的共转染比例，通过IP实验后用RL抗体的WB实验来表征靶蛋白糖基化水平，最终采用了最小阈值1: 0.05。随后，他们验证了OGTACs与两个融合蛋白之间的结合能力。他们设置不同的给药处理时间，并用罗丹明配体与OGTACs进行竞争，通过凝胶荧光成像来检测没有与OGTACs结合的HTN-BRD4。结果表明，三个OGTAC分子均可实现HTN-BRD4的标记，其中OGTAC-1效力最高（图1 C）。他们用CETSA实验来验证OGTAC与fOGT的结合， OGTAC-1对fOGT热稳定性的提高同样最显著（图1 D）。![]()
随后，他们评估了OGTACs诱导HTN-BRD4的O‑GlcNAcylation的效力，三个分子都有效果，但OGTAC-1最优（图2 A）。他们对OGTAC-1进行了浓度依赖性实验，发现该分子诱导O‑GlcNAcylation的最佳浓度在256 nM到640 nM之间，并表现出hook effect。此外，Co-IP实验也证明了OGTAC-1诱导的三元复合物的形成（图2 B）。接着，他们对OGTAC-1进行了时间依赖性实验，结果表明诱导效果在4 h达到最佳，且会随着时间的延长有所减弱（图2 C）。 ![]()
为了验证OGTAC策略的普适性，他们又基于OGT已知底物CK2α构建了HTN-CK2α细胞系。结果表明，尽管OGTAC-1的IP效果不好，但诱导O‑GlcNAcylation的效果依旧显著（图3 A）。接着，他们用酶在O-GlcNAcylated的蛋白上标记上带有叠氮基团的GalNAz，并通过SPAAC反应接上一个5kDa的PEG链，最终导致免疫印迹实验中条带的上移,且OGTAC-1不影响内源性CK2α的O‑GlcNAcylation水平（图3 B）。随后，他们评估了OGTAC-1对HTN-CK2α的浓度和时间依赖性的效果（图3 C）。已知S347是CK2α上一个明确的O-GlcNAcylation位点，而S348与S347相邻，是潜在的替代位点。因此他们分别构建了S347A和S347A/S348A的HTN-CK2α，想要验证OGTAC-1诱导下HTN-CK2α发生O‑GlcNAcylation的位点。结果表明，OGTAC-1诱导的O‑GlcNAcylation主要发生在S347上（图3 C）。此外，他们也在OGT的表观遗传底物EZH2上验证了OGTAC策略的可行性。![]()
先前的实验中他们采用的是双融合蛋白系统，接下来他们想通过靶蛋白配体来诱导内源性POI的O‑GlcNAcylation（图4 A）。因此，他们将AP1867和JQ1连接在一起得到分子OGTAC-4（图4 B）。然而，他们在IP-WB实验中，用RL2的抗体并没有检测到内源性BRD4的O-GlcNAcylation信号。在过表达BRD4的细胞系中，他们成功验证了OGTAC-4诱导的O-GlcNAcylation，OGTAC-4在3 nM就能诱导稳定的三元复合物的形成（图4 C）。时间依赖性实验的结果表明，OGTAC-4在2 h内开始诱导BRD4的O‑GlcNAcylation，8 h后斜率增加，表明其诱导作用在24 h后仍未达到饱和（图4 D）。综上，他们认为OGTAC-4具有催化特性，功能高效且持久。随后，他们从BRD4的C端截短了一个片段(S1051到F1224)，该片段是鉴定出的可信度最高的O‑GlcNAcylation的位点。结果表明，缺失该片段后，OGTAC无法诱导靶蛋白的O‑GlcNAcylation，这表明该区域对于OGT的相互作用至关重要（图4 E）。![]()
随后，他们评估了OGTAC对整个O-GlcNAc蛋白质组的特异性。他们用免疫印迹法评估了整体的O-GlcNAc水平，对于CK2α这类已知的OGT底物而言，较低的fOGT蛋白量就足够发挥OGTAC-1的效力，但该条件下整体的O-GlcNAc水平变化不显著（图5 A）。然而对于BRD4这类有争议的底物而言，HTN-BRD4: fOGT = 1: 0.01的条件就不够了。他们猜测OGT蛋白水平的最佳阈值是BRD4发生有效O-GlcNAc的必要条件。为了平衡OGTAC对BRD4的效力和特异性，他们开发了一个截短的fOGT系统（图5 B）。其中，0tfOGT即使在高表达水平的条件下也仅诱导最小程度的整体的O-GlcNAc水平升高（图5 C）。接下来，他们将OGTAC-4应用于0tfOGT: HTN-BRD4系统，使得BRD4上的O-GlcNAc水平增加了5倍（图5 D）。这一结果表明OGTAC-4能够有效地利用截短的fOGT诱导BRD4的O-GlcNAcylation，而不影响整体的O-GlcNAc水平。最后，他们研究了OGTAC的可逆性。在OGTAC-4的洗脱实验中，由于JQ1和AP1867母核分别对BRD4和0tfOGT存在高亲和力，因此靶蛋白的O-GlcNAcylation和三元复合物的形成在OGTAC-4洗脱后仍然持续存在。然而，当单独加入AP1867后，三元复合物的形成在2小时内明显减少，表明AP1867可以有效发挥rescue功能，且BRD4的O-GlcNAc水平在AP1867处理6小时后能够回到基线水平，而整体的O-GlcNAc水平在该过程中依然没有受到影响（图5 E）。![]()
总结全文，该工作开发了一种新的化学遗传学技术，即OGTAC，通过化学小分子诱导的蛋白质互作，在活细胞内利用OGT调控靶蛋白质特异性的O‑GlcNAcylation，将会为研究蛋白质O-GlcNAcylation的功能提供一种强有力的工具。本文作者：NZH
