具有增强药代动力学特性的新型两性PROTAC用于降解ALK蛋白
文摘
2024-06-20 17:38
北京
近日来自四川大学华西医院肿瘤中心的团队在 JMC 期刊上发表了题为Novel Amphiphilic PROTAC with Enhanced Pharmacokinetic Properties for ALK Protein Degradation的文章。文章主要介绍了新型两性PROTAC在降解 ALK 蛋白中具有增强的药代动力学特性。![]()
尽管在抗肿瘤领域中PROTAC已成为药物开发领域最有前途的技术之一，但阻碍PROTAC技术进步的主要挑战包括水溶性差、生物利用度低和肿瘤细胞选择性不足。为了克服这些障碍，该研究介绍了一种新的亲两性PROTAC，B1-PEG，通过优化的PROTAC分子B1的PEGylation合成，以增强其特性。B1-PEG在水中自我组织成胶束，并在肿瘤细胞释放其活性形式，以应对肿瘤特异性高GSH环境。药代动力学分析显示，B1-PEG的优越生物利用度为84.8%，优于未经修饰的PROTAC分子B1。在H3122异种移植小鼠模型中测试时，B1-PEG显著抑制瘤体的生长，强调了其作为靶向癌症治疗的强大候选者的潜力。该发现为克服PROTAC药物设计中的生物利用度限制提供了一个有希望的方向。![]()
图 2
EML4-ALK融合基因被认为是非小细胞肺癌（NSCLC）最重要的驱动因素之一。目前已经开发了几种基于第二代ALK抑制剂的EML4-ALK降解剂，并证明了其蛋白质降解的潜力。然而，这些分子有溶解度或生物利用度问题，如B3和AP-1。为了确保EML4-ALK蛋白的降解能力并保持该分子的疏水性，作者开发了带有烷基链接剂的ALK降解剂，然后通过二硫键连接PEG分支，以产生目标两亲性PROTAC。由于两亲性PROTAC分子由亲水性末端和疏水性末端组成，因此假设两亲性PROTAC可以在水溶液中自组装成胶束颗粒，从而提高PROTAC分子的水溶性。此外，低水平的外周循环GSH保持两亲性PROTAC分子的稳定性，延长其在体内的循环时间，从而增强其PK特性（图2A）。随后，由于肿瘤细胞中的GSH水平高，亲两性PROTAC分子中的二硫键迅速减少和断开，从而释放活性PROTAC分子并发挥其抗肿瘤增殖作用。相比之下，正常细胞中较低的GSH水平使二硫键不太可能减少，从而避免了大多数有毒副作用。![]()
通过评估多个PROTACs在几个细胞系中的抗肿瘤增殖活性和靶蛋白降解功效。B1-PEG被选为进一步研究ALK蛋白降解机制的候选分子。如图3F所示，使用0.25 uM B1-PEG治疗4小时后，ALK蛋白水平下降，并在24小时达到最大值。相应地，p-ALK水平持续抑制，仅在48小时后略有恢复。此外，通过用蛋白酶体抑制剂MG132或E3配体Pomalidomide预处理细胞，证明EML4-ALK蛋白被B1-PEG分子降解取决于UPS系统（图3I）。与此同时，p-ALK蛋白的水平也相应增加。然而，对于Ceritinib预处理组，尽管ALK蛋白的降解被部分抑制，但它仍然不影响其对ALK磷酸化的抑制。![]()
在表征两亲性PROTAC分子B1-PEG的胶束形成能力和细胞吸收能力之前，首先研究了B1-PEG在PBS和GSH环境中的稳定性。在PBS缓冲液中孵化2小时后，B1-PEG的含量基本保持不变（图4A）。然而，在含有2.5 mM GSH浓度的PBS缓冲液中，B1-PEG分子在还原其二硫键后迅速降解，同时产生产物B1-SH和B1-SS-GSH（图4B）。随后，对两性分子B1-PEG在水溶液中形成胶束的自组装能力进行了初步表征。在透射电子显微镜下观察到由B1-PEG自组装的规则形状的球形胶束的形成（图4C）。这些证据证明B1-PEG作为两亲性PROTAC分子，具有在水溶液中自组装成胶束的能力。有趣的是，在实验过程中观察到B1-PEG分子的水溶液在被紫外线激发时表现出绿色荧光。因此，利用这一功能来研究B1-PEG的细胞吸收能力。用B1-PEG预处理H3122细胞，浓度为1uM，并使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）测量其发射光谱。结果表明，在405纳米的激发波长下，B1-PEG分子的最大发射波长为513纳米。随后，使用CLSM研究H3122细胞在不同浓度下对B1-PEG的细胞吸收，并对吸收机制进行了初步调查。如图4D所示，在给定浓度下，H3122细胞对B1-PEG的吸收没有表现出明显的浓度依赖性。当用内吞作用抑制剂阿米洛利、氯丙嗪和基因位酮治疗细胞时，在用阿米洛里治疗的组中观察到荧光显著减少。这表明B1-PEG形成的胶束通过大肾小球细胞增多介导的内吞通路被细胞积极吸收。与被动运输相比，这无疑允许药物更有效地进入细胞，从而发挥其治疗效果。作者推测，这种荧光效应是由波马利度胺引起的，这一发现可能对研究具有类似结构的PROTAC分子的细胞和组织分布具有积极影响。然而，具体的机制仍然需要进一步验证。![]()
图 5
为了研究B1-PEG的体外抗肿瘤机制，利用流式细胞仪进行细胞凋亡分析。21.3%的H3122细胞在接受1uM B1-PEG治疗48小时后发生凋亡，而Ceritinib治疗组仅观察到16.6%（图5A）。对于细胞周期分析，发现B1-PEG在较低浓度下阻止G0/G1相的细胞周期的能力很弱，但这种能力随着浓度的增加而显著增强（图5B）。特别是当浓度达到1μM时，化合物B1-PEG在G0/G1阶段抑制了高达84%的细胞，这与阳性对照Certinib（1μM时为82.5%）的情况相似。这些结果的原因可能是，与ALK抑制剂塞里替尼的“占用驱动”机制不同，B1-PEG作为ALK降解剂，可以显著降低细胞内ALK水平，并完全抑制其酶和非酶功能，从而导致强大的抗肿瘤增殖作用。克隆形成分析评估经过B1-PEG处理的H3122细胞的致癌能力，B1-PEG以浓度依赖性的方式显著减少了克隆的数量，并且在0.5uM下完全抑制了克隆的形成。这些结果表明，B1-PEG可以有效诱导G0/G1阶段H3122细胞的细胞周期停止，从而诱导早期凋亡，并最终抑制H3122细胞的增殖和入侵。![]()
为了进一步研究B1-PEG的体内抗肿瘤疗效，对大鼠的B1-PEG和B1进行了PK分析，相应结果如图6所示。通过静脉或腹腔注射给大鼠注射单剂量B1-PEG或B1，然后在不同时间采集静脉血液样本，并分析药物浓度水平。发现B1-PEG和B1在给药后都被迅速吸收，但B1-PEG的吸收率和峰值血浆浓度明显高于B1。给药4小时后，B1-PEG的血液浓度达到最大值，Cmax值为166.7微克/毫升（53.8纳摩尔/毫升），而B1的C最大值为0.3微克/毫升（0.3纳摩尔/毫升）。B1的绝对生物利用度为63.5%，而B1-PEG的绝对生物利用度已大幅提高，达到84.8%。这些结果表明，与B1相比，化合物B1-PEG具有增强的PK特性，适合进一步研究体内抗肿瘤活性。![]()
基于B1-PEG和B1在PK分析中的优异结果，接下来评估了B1-PEG和B1在H3122异种移植模型中的疗效。治疗18天后，所有治疗组的肿瘤体积都显著减少（图7A和B）。特别是，使用B1-PEG（I.P.，75 mg/kg）治疗的小鼠的肿瘤体积表现出明显的回归，而B1的肿瘤生长抑制（TGI）率仅为71%，同一剂量的塞里替尼仅为88%（约25微摩尔/千克）。还进行了免疫组织化学（IHC）和WB分析，探测肿瘤组织中的EML4-ALK表达水平（图7D和E）。B1-PEG和B1治疗组的EML4-ALK蛋白都低于载体组。至于塞里替尼治疗组，没有观察到EML4-ALK蛋白水平的显著下降。在给药期间，治疗组的所有小鼠都存活下来并保持了稳定的体重，没有观察到明显的体重下降（图7B）。最终剂量后，对小鼠进行安乐死，并使用H&E染色收集器官进行组织病理学分析。每个治疗组的生理形态和功能都是正常的（图7F）。这些结果表明，B1-PEG具有良好的体内安全状况。总之，与相同剂量的化合物B1和阳性对照塞里替尼相比，B1-PEG表现出优异的肿瘤生长抑制。此外，与B1相比，它表现出增强的PK特性。这一发现有望加速PROTAC药物的临床开发。然而，拉长的PEG链可能会增加药物的分子量，需要更高的剂量，过多PEG片段可能会导致不可预见的免疫原性，在后续研究中需要谨慎设计。本文作者：LYJ
