最新：分子胶诱导的CRBN的互作蛋白组的全面揭示
文摘
2024-09-27 15:53
北京
今年9月17日，来自Dana–Farber Cancer Institute和Harvard Medical School的Katherine A. Donovan和Eric S. Fischer合作，在预印本上online了一篇文章，全面揭示了分子胶诱导的CRBN的互作蛋白组。
作者建立了一种简化的IP-MS方法，通过在细胞裂解液中使用重组蛋白作为诱饵，创建了一个可控的环境，以减少生物学变异性。通过简化的IP-MS方法，作者在细胞裂解液中使用FLAG- CRBN和DDB1蛋白复合物作为诱饵，用flag抗体富集了与小分子降解剂形成的复合物。在MOLT4和Kelly细胞系中，使用pomalidomide和SB1-G-187（一种激酶双功能降解剂），鉴定出11个蛋白(9 in MOLT4 and 4 in Kelly cells)，其中有三个未被报道的新靶点ASS1, ZBED3 and ZNF219。这三个新靶点经过了TR-FRET的验证。![]()
为了优化和解决对灵敏度和高通量的关键需求，作者自动化了富集和样品制备程序，显著提高了实验的灵敏度和通量。在对20种不同的IMiD类似物进行筛选后，结合MOLT4和Kelly细胞系的数据，共鉴定出298个蛋白，排名前五的是PATZ1, ZBED3, WIZ, IKZF2和ASS1，其中.ZBED3和ASS1是非降解型互作靶点。在这鉴定出的298个靶点中，270个均为发现的新靶点。作者根据超家族和结构域的特征对这些靶点进行了分类，计算了相应的占比。![]()
在298个被鉴定的蛋白质靶标中，作者发现C2H2型锌指超家族是最大的靶标类别，占所有靶标的14%以上。这一发现与之前的研究结果相一致，即CRBN分子胶倾向于招募含有C2H2型锌指结构域的转录因子。作者通过比较不同细胞系中鉴定的锌指蛋白，发现了一批在MOLT4和Kelly细胞系中均被富集的锌指蛋白。这一结果表明，这些锌指蛋白可能代表了CRBN分子胶的常见靶标。为了进一步验证这些锌指蛋白与CRBN的相互作用，作者利用AlphaFold2（AF2）数据库中的结构信息，对这些锌指蛋白进行了结构比对。通过计算模型，作者评估了这些锌指蛋白与已知CRBN-IMiD复合物的结合潜力。作者特别关注了锌指蛋白中的G-loop结构，这是CRBN分子胶招募的关键结构特征。通过分析，作者发现多数被鉴定的锌指蛋白含有与已知CRBN结合的IMiD分子相似的G-loop结构。除了已知的锌指蛋白靶标，作者还鉴定了一批新的锌指蛋白靶标，包括ASS1、ZBED3、ZNF219、ZMYND8和RNF166。 ![]()
在298个靶标中，作者发现251个非ZF蛋白被富集，这些非ZF蛋白包括蛋白激酶、RNA识别基序蛋白、代谢酶、翻译蛋白等，涵盖了不同的生物途径。通过TR-FRET实验验证了这些新靶标的直接招募，并使用结构G-loop对齐来辅助确定这些新靶标。其中，通过cryo-EM结构分析，作者揭示了PPIL4和PDE6D与CRBN-DDB1DB-FPFT-2216复合物的结构。晶体结构显示，PPIL4的RRM结构域三元复合物的形成中发挥重要作用。因此，具有RRM结构域的蛋白可能是一种分子胶诱导下的CRBN的新底物。![]()
作者通过生化筛选约6000种IMiD类似物，针对PPIL4进行了TR-FRET筛选，鉴定了一种新型先导化合物Z6466608628，其对PPIL4的招募效果优于FPFT-2216。![]()
