泛素途径中转硫醇中间体的结构基础
文摘
2024-10-16 10:07
北京
泛素化途径是真核细胞蛋白降解的最主要途径，这一途径中的泛素转移过程涉及转硫作用。在泛素化途径中，E1酶催化从E1~Ub硫代酯到E2~Ub硫代酯的转硫作用。将泛素从E2~Ub硫代酯转移到HECT型和RBR型E3连接酶以形成E3~Ub硫代酯也需要转硫作用（图1a）。然而，泛素化通路中的酶如何驱动硫酯键的等能转移仍不清楚。近日，美国Howard Hughes Medical Institute的Christopher D. Lima等研究人员合作揭示泛素途径中转硫醇作用中间体的结构基础，相关成果发表在《Nature》杂志上。 ![]()
图1
首先，研究人员开发了一种Ub-PSAN探针（图1b），它是一种双亲电性探针，包含3-[phenylsulfonyl]-4-aminobut-2-enenitrile结构。这个探针能够通过两个亲电性基团与蛋白质中的两个半胱氨酸残基共价结合，从而稳定地模拟转硫反应中的四面体中间体，用于后续的结构生物学研究。通过SDS-PAGE实验（图1c）证明，该探针成功地获得了目标中间体。研究人员使用冷冻电镜解析了双重加载的E1（同时结合两个泛素分子）和单重加载的E1（只结合一个泛素分子）孵育的E1–Ub(T)–E2复合物的结构（图2，T表示Ub与硫酯键相连）。这些结构图像揭示，在Ub从E1到E2转移的过程中，Ub的C末端共价连接到E1和E2活性位点半胱氨酸，而Ub(T)主体通过180°旋转和平移35 Å在给体和受体构象之间转换。研究者推测 E1 和 E2 活性位点残基的重塑可能会在转硫化过程中产生方向性，但在 Ub(T) 的整个构象变化过程中，转硫化活性位点周围的氨基酸和侧链构象保持相对恒定。![]()
图2
研究人员通过cryo-EM得到的重建图像显示了E1在结合Ub(A)和ATP•Mg2+时的多种构象（图3）。这些构象变化涉及到E1的SCCH域相对于E1腺苷酸化结构域（IAD和AAD）的旋转和平移。ATP•Mg2+单独或与Ub(A)-AMP（A表示腺苷酸化）复合物一起，也能增强E1到E2的Ub(T)转移速率。这种促进作用是通过E1结构域的运动实现的，这些运动与Ub(T)向E2的转移相偶联。ATP•Mg2+单独或与Ub(A)-AMP腺苷酸化复合物一起，也能增强E1到E2的Ub(T)转移速率。这种促进作用是通过E1结构域的运动实现的，这些运动与Ub(T)向E2的转移相偶联。![]()
图3
下一步，研究人员研究了E2–Ub(T)–E3HECT转硫反应类似物的结构（图4）。通过解析了Ub(T)从E2向E3HECT转移过程中的构象连续体，研究者发现Ub(T)从靠近E2的位置转移到E3HECT C-lobe附近的位置，而Ub(T)的C末端仍然共价连接到E2和E3HECT的催化半胱氨酸残基。E3HECT的N-和C-叶保持相对不变，与之前报道的结构相似。Ub(T)的构象变化伴随着Ub(T) C末端尾部的构象变化，这些尾部在状态1到3和状态4到7之间有明显的不同。尽管E3HECT–Ub(T)产物的结构没有观察到，但Ub(T)构象在状态1到状态7之间的转变表明Ub(T)正在旋转并移向C-lobe，状态5到状态7接近在C-lobe上观察到的Ub(T)构象。这些结构和功能数据，揭示了E2–Ub(T)–E3HECT复合物在转硫反应中的动态变化，以及E2和E3HECT之间的相互作用如何促进Ub(T)的转移。![]()
图4
为探索E2在转硫反应中的作用，研究者通过重建模型展示了E1–Ub(T)–E2复合物中Ub(T)处于受体位置（状态10）和E2–Ub(T)–E3HECT复合物中Ub(T)处于给体位置（状态1）的情况（图5a、b）。研究表明，E2表面的一些残基与Ub(T)的相互作用对于维持E2与Ub(T)的复合物稳定性至关重要，并且这些相互作用可能因E1和E3HECT复合物的不同而有所差异。为了测试E2表面残基在转硫过程中的作用，研究者构建了E2的突变体，并在与E1或E3HECT的转硫反应中进行了测试（图5c、d）。结果显示，特定的E2突变体可以增强或减弱转硫反应的效率。研究还发现，E2表面的某些残基突变可以稳定或破坏E2与Ub(T)的闭合构象，进而影响转硫反应的方向性和效率。图5e、f提供了E1到E2转硫反应和E2到E3转硫反应的示意图，指出了Ub(T)构象变化和E2环重塑的方向。![]()
图5
总而言之，这篇研究探讨了泛素(Ub)和泛素样蛋白(Ubl)在调节蛋白质活性、稳定性、定位或相互作用中的作用。研究者们通过一系列生化实验和结构生物学方法，包括冷冻电镜(cryo-EM)，揭示了在泛素化途径中，E1激活酶、E2结合酶和E3蛋白连接酶之间转移泛素化中间体的瞬态和不稳定的转硫反应中间体的结构基础。该研究通过化学方法捕捉和可视化泛素途径中转硫反应中间体的稳定类似物，以了解其促进泛素转移和泛素化反应的化学步骤和构象转变。该研究的意义在于提供了对泛素化途径中关键反应步骤的深入理解，这对于理解蛋白质调控机制、疾病发生发展机制以及开发相关药物具有重要意义。
