继续测序的脑洞实验。
前面我们已经问过，到底需要多快的测序，10美元的基因组测序还有多远（案例），如果对全球80亿人口进行测序还需要多少测序能力…
在测序仪开发的场景里，我们已经介绍过乔纳森大神的99 美元的家用测序仪，尝试讨论了马桶（蹲坑）测序的机会…
这次，我们落地一点，试问，如果每个人的手机都能用于测序，会怎么样？
测序的可及性曾是被诟病的一个待满足需求，于是在大型冰箱式测序仪之后出现了桌面式测序仪的热潮，自此开始了测序仪的打印机化仪器加耗材模式。但这依然太笨重了，人们在便携的追求上更进一步，开始思考是否可以手持。
ONT的MinION现在已经成了手持测序仪的代名词，空前绝后。MinION上天入地，只需要连接你的笔记本电脑就可以进行实时测序。但这似乎还不够，更进一步地，如果它能直接连接手机进行测序，岂不是更方便？
这也是ONT在做的，SmidgION设计的目标就是直接type-c连接手机进行测序，里边整合了其纳米孔测序的芯片和ASIC。ONT在SmidgION的开发上经历了几个版本的迭代，这受到样本提取-自动建库开发的限制，也受到测序芯片成熟及迭代的影响。不过从今年5月份LC大会上的展示来看，SmidgION测序芯片原型已经可以工作并产生数据，看看明年会不会有EA？
如果手机可以直接用于测序，那么可及性的问题可以被最大化地解决，它提示了可能的普适性和40亿智能手机背后潜在的用户群体。
纳米孔测序借助手机所提供的电源和计算资源进行实时测序的电信号读取和初步分析。
现在智能手机的芯片和运算当然还赶不上GPU的设置，但通过CPU的架构优化，之前也有不同的报道提示了可以在手机上进行测序数据甚至是全基因组数据的分析，如iGenomics、Genopo、DNAApp、DNA2App等。随着SmidgION的发布，相信会有更多的类似APP出现。
手机当然是一个移动网络终端，即便自身计算资源受限，也不妨碍其通过更快的通讯协议实现数据的云端上传及扩展分析。而且，随着Apple Intelligence推动移动智能进入GPT时代，我们也很难臆断GPT手机端的数据分析会进入什么新奇的形态。
自媒体时代，手机最重要的一定是拍照功能。手机的摄像头配置也越来越高，而这对于传统的基于发光或成像的检测来说，可能是一个摆在眼前的机会。
将手机用于测序，过去已经有一些探索，但必须指出的是，我们现在的手机一定比十年前的更高级、更智能。如果拿AI手机再去做之前的事情，效果可能会更出奇。
2010年左右，英国公司QuantuMDx (QMDx)曾定位在测序的开发上，它们从纳米技术先驱查尔斯·利伯教授那里授权了基于纳米线的场效应晶体管（FET）作为生物传感器的技术，进行测序的开发，目标是开发世界上第一台手持式 DNA 测序仪。
硅纳米线阻抗的变化可以记录生物分子的到达和结合，QMDx使用肽核酸 (PNA) 将 DNA 测序模板束缚在纳米线上，当核苷酸到达模板时，它们的负电荷会影响纳米线并改变其阻抗。这一过程可以使用可逆终止技术，加上supercharged修饰核苷酸，通过SBS循环可以用于测定模版的序列。
当然，最终我们也没有看到QMDx的手持测序产品诞生，QMDx后面因为经费和开发的难度也放弃了测序部分的投入，转而集中在POCT的开发上，推出了手持式即时诊断仪器Q-Poc，一个大号 iPhone。
与QMDx很类似，通过使用纳米分子线连接两个电极来展示分子线上所结合分析物所造成的电阻抗变化，RosewellBiotechnologies公司提出了基于生物分子的新型微芯片的概念。这并不是一个新的概念，但之前的尝试都未兑现其承诺。
Rosewell开发了ME 1947 的原型芯片，它的尺寸为一平方厘米，看起来有点像标准的“Intel Inside”微芯片，它在薄薄的灰蓝色金属晶片中嵌入了微小的纳米传感器电路圈。设计用于检测生物分子及相互作用时产生和读取电信号。Rosewell的芯片可以检测的远不止“阳性”和“阴性”的结合事件。通过在分子线上配备聚合酶，这些酶在复制 DNA 中的 A、G、C 和 T 碱基时，传感器线可以检测到这些不同碱基所引起的特异信号，进而用于测序的目的。
但测序并不是Rosewell追求开发的首要目标，关于其未来的发展，Rosewell有很多设想，包括分析 DNA 聚合酶、小分子、抗体、适体、寡核苷酸、CRISPR-Cas 酶等的结合动力学，用于检测病毒、呼气检测、药物发现等领域。但不幸的是，自2022年出发表概念验证文章之后，Rosewell就停止了更新，可能离其愿景中的未来也越来越远。
不管是QMDx还是Rosewell，本质上都还不是手机测序。那么，手机有没有可能用于NGS？
2016年，大名鼎鼎的Mats Nilsson小组发表文章证明，可以通过手机显微镜进行成像和分析，对保存的肿瘤样本进行靶向NGS测序反应和原位的点突变检测。
Mats Nilsson将挂锁探针与滚环扩增相结合开发了多个创新的工具和诊断方法，又将原位分析与NGS相结合开发了原位测序技术。2017年的这篇文章是其大胆的一个尝试，通过使用手机摄像头对玻璃载片上通过RCA扩增的单个分子进行成像，在大视野范围内对肿瘤组织样本进行成像，将分子分析与肿瘤组织形态学和病理学结合了起来。
他们为手机设计一个光机械附件，其中包含两个用于荧光成像的激光二极管和一个用于明场透射成像的 LED。然后开发了两种不同的分子分析方法，一种是使用选择探针和连接测序的靶向 DNA 测序方法，另一种是原位突变分析，用于查看 RNA 片段中的特定 KRAS 突变。
从A427 细胞中（KRAS密码子12发生突变）提取的基因组 DNA 中KRAS密码子 12的靶向 SBL 反应的双色手机显微镜图像。 RCP 要么用对应于碱基 G（KRAS野生型）的 Cy3 染色，要么用对应于碱基 A（KRAS突变型）的Cy5染色。
在靶向 DNA 测序中，他们首先从肿瘤样本中提取 DNA，并用限制性酶消化，产生190 个碱基对的片段。将KRAS DNA 片段选择性地杂交附着到载玻片上的KRAS选择探针上。然后，DNA 片段在载玻片上连接，使用 RCA 扩增环化片段，并通过连接测序选择性地对 KRAS 基因的第12-13个密码子进行测序。最终通过他们的手机显微镜在两个荧光通道上对 DNA 测序反应进行成像。
为了对下一个核苷酸位置进行测序，需要通过UNG处理酶去除锚探针中的Uracils并削弱杂交，从而去除连接好的测序文库和锚探针。进行手动清洗之后，通过杂交相同的锚探针和添加包含测序用的这组探针混合物来进入下一个测序循环，新的探针可以查询第二个碱基的信息，再放置进入手机显微镜进行读取。
结果提示，通过足够深度的测序，这可能达到与FDA批准的基于 PCR 的 KRAS 测试相当的灵敏度水平。
基于手机显微镜的序列分析：(i) 测序反应的荧光成像，和 (ii) 通过定制的自动图像分析算法进行碱基调用。
同样，可以在手机显微镜上添加第三个荧光通道并进行常见的 RCP显色来实现更高的准确度，这有助于丢弃那些导致非特异性信号并限制准确度的自发荧光物体。
当然，上述方法中的样本处理步骤尽管相对简单，但还需要手动操作，反应混合物的制备和移液步骤需要实验室技术人员。进一步的自动化可能会促进这一方法在临床环境中的更广泛实施和使用。
为了探索与微流体集成的初步可行性，他们还使用手机显微镜直接通过连接到样品载玻片的流动池对原位RCA检测进行成像，结果非常令人满意，表明液体处理也可以集成到同一个基于手机的界面上。
基于手机的分子诊断分析可将分子标记信息与传统形态分析相结合，其他重要应用可能包括传染病诊断，其中病原体身份和负荷以及抗生素耐药性标记可能使用相同的手机平台进行测量。
整体上，这一工作表明，凭借简单的 DNA 测序文库制备方案和对 NGS 反应进行成像的能力，基于手机的成像和测序是可行的，这对于靶向测序特别有用，其简单的设置适用于分子病理学在POC甚至资源有限的环境中的应用，有可能因此也减少NGS诊断的成本。
但不管是这里的RCA滚环扩增实现信号放大，还是基于连接的有限碱基序列读取的循环操作，或只是用于实现特定变异的靶向检测，这些都提示了使用手机显微镜进行传统下一代测序的难度和挑战。除此之外，测序成像所必须的荧光激发不管怎么样都不是手机所自带的，需要通过额外的附件来提供；而如果想要实现所谓的测序循环，那么流体部分的自动化实现及控制也需要更多设计考虑。
手机测序可能是一个美好的念想，但似乎不太适用于循环式SBS的下一代测序技术。
但就像454.bio所提示的那样，如果能够实现一锅式的测序化学，或许通过这个手机显微镜的思路，手机测序可能会起死回生。
期待SmidgION，期待看到更多创新。
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