过去这二十年，高通量测序的形式似乎没怎么变过。
当Element Biosciences在两年前推出其第一款测序仪AVITI时，它“重新设计了测序的每个元素”，在表面化学、测序化学、光学、工作流程、碱基识别等测序仪运作的核心元素上都构建了自己的创新方案。
特色鲜明的Element解决方案
定位在中通量上，AVITI试图打破测序上“质量-通量-成本”这个不可能的三角。传统上，在合适的通量下，测序的成本和价格一直是一个选择的障碍。AVITI的仪器开发首先通过灵活的通量设置让测序变得可承担、愿意支付。2023年初，Element宣布了在AVITI上可实现的200美元基因组，无需超高通量的仪器，无需凑样。这让行业为之一震。
在合适可及的价格点提供一个性能更优的测序平台，这不光是客户的声音和内心需求，更成为了Element产品开发的主线。
在推出AVITI PE150产品之后一年，Element对其测序生化做了第一次重要升级，推出了Cloudbreak化学，其中一个最显著的效果就是缩短了测序反应的时间，300个循环的测序运行可以减少10个小时。Cloudbreak随之构成了其Avidite Base Chemistry (ABC) 测序化学的核心。
在通量上，当客户希望从AVITI获取更多测序数据的时候，通过软件的改进，Element推出了高产模式HD （High Density），让客户在同一运行中产生20-70%以上的更多数据；当客户希望减少一点通量，进而再降低些成本的时候，Element推出了更低通量的配置（AVITI LT和low output kits，设计75-150Gb的产量），而且设计流通池上每条流道都可以分别加样（individually addressable lanes），通过这样的灵活性进一步推动测序可负担。
Element系统的一个优势在于使用了环状DNA和滚环扩增RCA进行目标序列的放大，从而提升了扩增的保真度，避免了PCR扩增引入错误的问题，同时也降低了dup rate。而ABC化学将目标序列中的碱基探测和掺入进行了分离，使用了Avidite这种独特的“八爪鱼”式多臂分子设置，可以同时掺入滚环后Polony“球束”中的多个位置进行探测，这种高特异性使得其在使用极低浓度的试剂量下即可以产生一个比较清楚的碱基识别信号，同时多点结合的设计，也可以减缓在NGS测序中制约测序长度的phasing和pre-phasing问题。洗去Avidite后，可以掺入只带阻断基团的修饰核苷酸，这样也减少了“疤痕”DNA链的形成，这通常与SBS过程后期聚合酶效率下降及200nt大小的较短的合成链长度相关。
所以，当微生物领域的客户、当免疫研究的客户群体问及更长片段的测序时，Element做了响应，内部孵化并在6个月后推出了PE300的试剂盒。竞争对手的PE300在每个运行特别是第二个300循环的尾端会出现数据质量的大幅下降，而得益于ABC测序化学，Element在2个300循环中都保持了较高的读取质量，这样客户在观测16S宏基因组或者免疫细胞受体序列时会更加自信。
但环状文库和RCA毕竟不是当下主流的测序建库方式，客户在使用的时候，如果考虑到转换比较麻烦，可能就不会去做这样的选择。虽然Element在一开始就意识到了这个挑战，并且已经有Adept这样的产品提供给客户进行文库的转换，但这还是引入了额外的操作。今年，Element推出了Freestyle测序试剂盒，对于客户来说，可以将线性文库DNA直接加载到流通池上，当流通池上固定的接头捕获了这些文库分子之后，可以直接进行RCA扩增，然后进行ABC测序。完全freestyle，不需要转换，无缝衔接，从解决需求的角度讲，可谓完美。
持续突破可能的界限。在通量、灵活性之外，在测序数据质量上，Element再次证明了ABC的优势，推出了UltraQ试剂盒，解决了文库制备中可能产生的错误，进一步改进了测序化学提升测序质量实现了70%以上的读取Q50，这其中90%的读取实现了Q40以上的质量。这无疑是目前所推出的所有测序产品中质量最高的，为测序准确率建立了一个新标杆。
回顾过去这几年的发展历程，Element本质上就是在打破常规，不满足于市场主流产品因而破釜沉舟、革新并推出了特征鲜明的Element解决方案。而这些解决方案又可以无缝衔接主流的工作流程，使得用户大大减少了转换甚至是费事操作的环节，最终用户可以集中精力于增加的数据、多样的结果和不断扩展的见解分析上。
作为一个后进入的NGS提供商，这既是聪明的，又是引领的。Element不只是重新设计了测序的每个元素，更是在重新想象“什么是测序”、“测序还能怎么做”、“测序之外还能做什么”...
Element在最近的市场活动Beyond上详细介绍了年初宣布推出流通池上杂交捕获的Trinity和单细胞多组学分析仪AVITI24这两款新产品，这可能就是Element“重新想象测序”后产出的两个具象呈现，但又都十分形象地展示了Element产品开发的一贯思路和Element解决方案的鲜明特色。
Trinity – 革新繁复老旧的靶向测序流程
听取客户声音，创新开发产品，最终改善用户体验。对于这个路径来说，Element已经不陌生了。
杂交捕获自商业化以来一直很受欢迎，它允许用户针对感兴趣的基因、以相对较低的成本进行富集和选择性测序。这在全基因组测序成本高昂、竞争不充分的NGS发展初期是权衡之下更合适的选择。随着NGS逐渐进入临床和目标明确的常规应用，panel和全外显子组测序等形式还将持续存在。
但进行外显子组等靶向测序涉及靶标富集，这可以通过传统的PCR扩增来实现，但其在所能产生的扩增子的大小及内容方面存在着天然的限制。2000年代初，基于探针的杂交捕获富集技术被开发并迅速被商业化，现在已经变成一种非常常见的技术手段。
然而，杂交捕获的一大烦恼是，这至少需要一天的样品准备时间，并且涉及非常繁琐的多步操作。
对于基因组测序来说，用户只需要从样本中提取 DNA，进行片段化、末端修复、加A 尾、连接接头后进行测序。而对于外显子组测序，除了所有这些操作，还需要进行杂交捕获，将上面获取文库与捕获磁珠孵育结合，这些磁珠结合了与要捕获的序列互补的寡核苷酸探针。探针杂交反应可能需要 4-16 小时（当然时间越长反应越充分），然后在不同的温度下进行多次冲洗，然后还需要经过PCR扩增这些从磁珠上洗脱的DNA文库，进行QC和混样等步骤，才能进行上机测序。
对于很多用户来说，这是一个耗时耗力的过程。然而，这一操作流程自2008年商业化以来基本上没有任何变化。讽刺的是，明明这是一个用户使用的痛点，竟然没有太多提供商去主动去解决这样的未满足需求，直到Element听到了这个声音。
在Element看来，利用AVITI的流体元件简化靶标富集是一个很自然的想法，为什么不能直接将流通池直接功能化，使得其可以只捕获那些想要的DNA片段或是panel。基于这样的想法，Trinity就诞生了。
Trinity重新设计并现代化了用于NGS的杂交富集技术，首先实现了流通池上的靶标富集。Trinity要做的就是消除传统流程中繁复的步骤，不需要磁珠的结合和冲洗，直接将杂交后的产物加载到测序流通池上，然后测序仪完成剩下的工作，而测序的运行时间不会因此显著变化。
Element重新设计了流通池表面和生化体系来支持Trinity应用。最终，用户只需要将杂交反应液直接加载到流通池上，在杂交步骤之后，就不需要其他手动操作了。Element还引入了超快速的杂交操作流程，使得杂交可以在一个小时内完成。
Trinity发布了两种选项，PE75和PE150，在标准PE150的设置下，每个流通池可以运行24个样本，可以实现高达50x的平均靶标覆盖。
开发这样一个新技术，除了简化工作流程，理想状态是至少不牺牲常规的测序表现。
Trinity实现了比预期更好的效果，将传统的16小时工作流程缩减到只需要几个小时，将传统的复杂的杂交捕获靶向测序流程简化为像WGS测序建库一样简单，这是行业首创。
从性能来看，Trinity可以实现90%的碱基质量在Q30以上，on-target比率在85%以上；也可以实现非常高的覆盖一致性，不管是从GC偏好的角度还是从fold 80的角度。
从下游数据来看，Trinity在两个方面体现了优势：一是显著降低了duplication的比例（duplication在杂交富集中比较常见，通常小于1%）；另一个是实现了3-4倍的文库复杂度（相同的文库通过Trinity操作相比常规的操作），理论上这将有助于检测罕见变异。得益于这两点优势，Trinity可以实现每个read的更高覆盖，实现文库的更高效测序。
Element现在发布的是Trinity exome产品，但Trinity应用理论上可以不局限于exome。客户自己的panel，如果使用的是基于Twist或者IDT的DNA探针，应该可以立即与Trinity兼容。虽然不管panel大小，都可以实现兼容，但比外显子组更大的panel肯定效果更好。较小的面板所需要的起始输入量就会增加，毕竟所要捕获的分子占输入样本的比例越来越小。持续增加扩展兼容和支持不同的捕获提供商是Element接下来要做的工作。
此外，明年Element将推出Trinity plus这个流通池上直接富集的产品。Trinity+的工作流程与 Trinity 略有不同。由于 Trinity 的快速杂交只需 1 小时，因此直接在流动池上进行高特异性捕获似乎能进一步节省的时间有限。Trinity+作为一种富集检测，最适用于增加靶向覆盖，以低覆盖率对完整背景文库进行采样、但需要对探针所针对的位点进行更深覆盖率的实验。Element列举了一些应用，包括low-pass低深度测序进行基因分型，在特定的位点获得更深的覆盖率；包括针对具有高外显子组覆盖率的结构变异进行low-pass WGS 以进行变异识别；包括宏基因组学或传染病测序，如添加使用针对毒力标记、抗生素抗性标记或特定菌株标记的探针；包括肿瘤MRD 或靶向的液体活检等。
将来，Trinity的应用还将会被拓展到RNA捕获、甲基化的靶向测序等。
Trinity之后，基于NGS的靶向捕获测序进入了一个全新的简化的流程。然而，这样的效果也是显著的，节省了冗长的操作时间及对自动化建库设备的依赖，实现了可比较的测序质量，又显著提升了每个读取的覆盖。
可以想象，Trinity将是革命性的，必然也将引领一个潮流。
AVITI24 – 引领单细胞多组学分析的新潮流
当很多人在问“NGS的未来是什么“的时候，Element已经交卷了，答案就是AVITI24。AVITI在两年后迎来了重要升级，这个2024版的全新AVITI就被命名AVITI24，当然它还有更多的意义。
AVITI24基于AVITI测序仪的硬件基础，不光是重新思考了测序本身，更是把NGS推向了Next-Gen NGS。AVITI24想要呈现的是一台超越测序的多组学分析仪。
如果说多组学是生物学的未来，似乎并不会遭到太多反对。测序的确可以提供一些答案，但生物学是动态的、是复杂的，它发生在细胞中除DNA序列之外的多个层面。因此，要更好地理解生物学，需要构建一个可以回到这些层面进行分析的工具。理想情况下，如果能够在单个细胞中结合所有这些层面的信息进行分析，那么我们就将开启全新的生物学探索的可能性。
在现阶段，想要获取细胞不同层面的信息，需要怎么做呢？用户通常需要结合不同的技术手段、通过不同的仪器来分别产生基因组、单细胞转录组、蛋白组及代谢层面的数据，通过整合这些不同类型、大概率来自同一个体不同样本（因为有些实验操作对于样本来说是破坏性的，使得其没办法重复利用）的数据来进行分析。
问题是，我们能不能把这些不同数据的产生整合到一次实验中来实现，这样既可以使用同样的样本，也可以在同一台仪器上甚至是同一次运行中完成，最终只需要对数据分析的管线进行重新设计就可以了。
这就是Element在考虑AVITI24开发时所了解到的用户需求和因此确定的理想产品特征。AVITI24希望实现NGS和单细胞多组学的同时读取和分析。
前面讲到，Element在开发AVITI的时候已经重塑并设计了很多底层的元素，包括高信噪比的ABC测序化学，包括大视野高分辨的成像系统，包括机载的数据处理和分析管线可以在短时间内处理复杂的数据。这些不同元素相结合，ABC测序理论上可以实现直接从生物样本中进行分析，把测序放到细胞内，只是这种环境更有挑战。要实现在同一个细胞样本中进行测序和cytoprofiling，虽然这些基本要素都已经存在了，但还需要对试剂、流程、效率等多个层面进行大量优化。
最终AVITI24实现了这一目标，以ABC测序为核心，在测序之外，还可以提供细胞形态、RNA和蛋白等的同时检测，在20平方厘米的承载面积上，每次运行可以分析200万个细胞，并且能在24小时的运行时间完成检测。
具体来说，今年上市最初上市的AVITI24即可通过6个靶标来分别标记识别细胞核、细胞膜、actin肌动蛋白、内质网、高尔基体和线粒体等特征，使用靶标特异性的小分子偶联寡核苷酸barcode，在结合靶点之后通过ABC测序来实现读出，通过定量检测这些寡核苷酸链上avidite结合的荧光强度进而测定这些细胞结构的的密度及形态等特征。这种cell paint的优势在于它不依赖于光谱的分辨率，而且是可逆的操作，这些标记被冲洗之后不会一直存在于剩余的成像过程中，因此也不会对下游的RNA和蛋白检测造成任何阻碍。
一旦完成了cell paint，就可以进入到RNA和蛋白的检测。RNA和蛋白的特异性检测的具体实现，Element并没有太多展开介绍，但大概率使用了偶联有寡核苷酸barcode的特异性探针。这些RNA和蛋白的探针在识别了特定的目标之后，可以被环化、被RCA扩增，并可以通过ABC测序实现特异的barcode标记的读出。最终，RNA和蛋白的检测就变成了基于测序的计数，所以理论上AVITI24可以实现单分子的检测灵敏度。而通过多轮测序可以增加相应计数，因此最终可以在每个细胞中检测到平均3000个转录本，实现检测到灵敏度和动态范围的提升。同样，通过使用磷酸化蛋白特异的抗体，也可以实现蛋白或磷酸化蛋白的高灵敏检测。
在极大优化了工作流程之后，Element推出了可以在AVITI24上运行的Teton assay，可以在一个运行中实现6个细胞形态标记物、350个RNA靶标、50个蛋白靶标（包括表面蛋白、胞内蛋白和磷酸化蛋白等）的读出和检测。
本质上，Teton assay是可以高度定制的，用户可以选择自己感兴趣的RNA和蛋白panel。在其最近在北京举行的Roadshow上，Element的CTO Mike Previte还提到他们将在后续推出定制服务和更多的panel及更广泛的样本兼容性，尤其进行蛋白检测定制时不需要进行conjugation，如果得以实现，将极大地降低定制的难度，提升效率。这是前所未有的。
Teton分析的工作流程也比较直接简便。细胞生物学的应用，通常从培养细胞开始。AVITI24提供了可以与Teton流通池相配套的细胞培养板，目前提供了12孔和单孔两种形式，12孔板可以实现每孔5万个细胞的培养，而单孔板可以实现每孔一百万细胞的规模。
Teton细胞培养孔板可以在标准的细胞培养箱中进行孵育，也可以进行药物处理，或者按照一定的时间轴进行不同的处理。在完成这些处理之后，板内培养的细胞将被进行固定（固定后可以直接进行储存，之后再进行分析），被固定后的细胞及培养板将被直接装在到一个AVITI的流通池上，被加载到AVITI24仪器上，运行Teton assay的分析。
在24小时的运行之后，所有关于上述的这些形态学、RNA和蛋白的数据都已经产生就绪。Element提供了细胞分割、强度定量（cell paint）、细胞分配（RNA和蛋白）、形态学特征提取等初级分析流程，这些都可以通过可视化的交互来进行分析，当然用户也可以通过第三方的软件进行进一步的分析。
AVITI24运行分析的效果如何？Element展示了一些数据并与其他常用方法进行了对比。
在形态学上，如上所述，因为使用了不同的细胞器的标记物的多种特征，因此这提高了细胞分割的准确率。
在RNA检测上，AVITI24与RNA-Seq及FISH进行了对比。AVITI24可以实现从低到每个细胞单个转录本到每个细胞上千种转录本的检测灵敏度，这实现了高达1000倍的动态范围，这在这个领域是一个独特的性能参数。在单个细胞水平，可以看到Teton assay和单细胞RNA-Seq的相关性，而低至单转录本水平，FISH和Teton assay也呈现了不错的相关性。
在蛋白检测上，AVITI24与免疫荧光进行了基准测试，两者首先显示了不错的相关性。前面说到，理论上，AVITI24可以提供单个分子的灵敏度，因此应当可以实现高灵敏的蛋白检测。质谱可以实现低至几百个蛋白分子的灵敏度，AVITI24与质谱检测的相关性如何？结果提示，AVITI24可以的确可以检测到不同丰度的较大范围内的蛋白质。
Element基于AVITI24第一个将发布的Teton assay重点关注MAP激酶细胞周期panel和MAP激酶相关的细胞凋亡panel。MAP激酶涉及比较复杂和动态的信号调控通路，这条信号通路里包括了药物研发高度关注的靶点。
Element团队演示了利用AVITI24的双流通池设置进行药物处理和细胞响应的应用案例。他们分别用TNF-alpha和TKI处理肿瘤细胞，观察在不同时间点这些处理所诱发的细胞形态及这些信号通路上关键RNA及蛋白的变化。结果可以看到一个高度异质化的、剂量依赖的细胞对药物的反应，而这种反应在单细胞水平更是显著不同。通过结合多组学的读出，AVITI24可以帮助更准确地理解这些药物处理的反应，而其中一些反应可能在某些靶标上更明显；也可以帮助在不同细胞状态下（如细胞周期的不同阶段）来探测RNA及蛋白的表达变化水平，甚至可以据此来分配细胞周期的状态。这些提供了一个观察复杂信号通路的窗口，以多组学的视角，提供了单细胞的分辨率和时间维度的动态。试想，只需要不到一个小时的手动操作，你可以在24小时内，在单细胞水平，研究多达200万个细胞的三个组学水平的变化，这是有多么不可思议。
除此之外，Element还预告了要在明年发布AVITI24的原位直接测序。如果你还记得上面我们说RNA/蛋白检测是计数，那这里就是希望对他们进行直接测序。
本质上，通过探针进行特异RNA位点识别，在进行连接和RCA之后通过ABC化学对靶标进行测序，可以实现单碱基的序列信息读取。但由于细胞是三维的形态，而且RNA转录本在细胞核及细胞质内可能也是三维散布的，因此如何克服并实现在z轴上的信号读取显尤为关键。Element称在z轴的第三维空间上实现了2.5微米的分辨率，可以对7个z轴切面进行扫描。
这样一来，Element实现了在细胞内原位100个循环的测序，这其中每个测序循环的时间和在AVITI上进行测序是差不多的， AVITI两边两个流通池提供了共20平方厘米可测序区域。
从测序原理上来说，这允许对对特定基因进行靶向测序，也可以通过对3‘UTR区域进行测序实现一个非偏倚的转录组分析。
由于流通池的表面化学及ABC测序化学可以产生非常低的细胞背景信号，与标准测序相比，这带来了非常低的phasing和pre-phasing错误。
对于非靶向的转录组测序运行，通过对比转录本丰度的分布，表明其与单细胞RNA-seq存在高相关度。然而，在AVITI24上实现这样的单细胞RNA-seq并不需要进行文库制备，而且可以实现更快的周转时间，只需极少的手动操作时间，在一台机器上完成，这大大降低了单细胞RNA-seq的难度。
这种独特的测序方式可以在一个运行中，在每个细胞中实现上百个polonies“球束”的多轮测序，意味着可以在一个细胞中检测上千个转录本，这克服了其他高重RNA分析中经常面临的光学拥挤的问题。
原位直接测序的场景可以有很多，比如可以对CRISPR筛选和药物发现中向导RNA进行测序，可以原位对T细胞/B细胞受体进行测序，可以对正在表达的突变进行直接表征，可以对非靶向的3‘端非转录区域进行测序，等等。这些可能会助力拓展遗传筛选、药物靶点发现及CAR-T细胞鉴定等应用。当然，原位直接测序也可以与cell paint及蛋白检测相结合，实现细胞多组学分析。
在AVITI24的路线图上，Element计划明年发布肿瘤免疫panel和神经panel，以及实现客户可定制的RNA+蛋白panel。直接原位测序将于明年下半年发布，并将拓展可支持的样本类型。
AVITI24本质上实现了单细胞的多组学，但不管是Teton assay还是明年推出的RNA原位测序在理论上都可以拓展到组织切片、类器官等多种样本类型。
Element设想AVITI24可能首先助力细胞生物学研究，但本质上，AVITI24是一台可以用于系统生物学研究的工具。AVITI24推出后，本质上用户不需要再费事进行多个平台测试的整合，只需要一次运行，就获得了24小时运行时间内的所有形态、RNA、蛋白及其磷酸化状态的多组学数据，这一定是革命性的。
从测序开始，但不止于测序。超越现有测序的所有可能性，这正是Element当下在践行的信念。
诺贝尔生理学或医学奖获得者Sydney Brenner曾经说过：“Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order”。我们见证了过去几十年技术迭代进步为生命科学所带来的变革。在基因组测序、GWAS分析、单细胞研究等各个领域，我们都见到了新玩家向旧王发起的挑战，以及技术变革所带来的崭新研究领域。
Element正在引领测序和多组学的创新和潮流，期待看到这将为生命科学研究会带来怎样的变革。
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