对于工业和学术界来说，单细胞和空间“组学”平台的选择越来越多。该领域发展迅速，任何从业者都很难掌握现有技术的实际知识。因此，scTrends 联盟 (https://sctrends.org/)被发起，以构建这些技术的“实时评论”。scTrends 是一项社区努力，随着平台和趋势的出现，它将不断更新。
在最近发表的评论中，scTrends联盟对已建立的平台和公司进行了简要的历史概述，揭示了市场趋势，简要概述了商业单细胞和空间分析解决方案以及一些伴随的工程进展，提出了技术如何脱颖而出的可能角度，然后从财务和法律角度介绍了市场观点，并考虑到这些公司可填补的市场空白。
单细胞和空间基因组分析技术是研究复杂生物和临床样本的标准，导致数十亿美元的市场；然而，产品特征和公司成功之间的联系正在不断发展。一些成熟的参与者，如10x Genomics、NanoString Technologies和Vizgen，通过检测可靠性、全面的技术支持和标准化的预处理管道，已经实现了对其技术的广泛接受。然而，此类技术通常与硬件的前期高成本有关。早期努力专注于增加细胞数量，能够在悬浮液中发现罕见的癌细胞和免疫细胞类型，但往往事先确定了细胞数量而不是测序深度。最近，重点逐渐转向新的应用，例如具有单细胞读数的集合CRISPR筛选。这些新兴技术可能导致范式转变：可能会有更少的细胞成为目标，但具有更大的敏感性，以更有效地阐明失调路径。同样，最初与分辨率限制作斗争的空间分析技术开发最近被多路复用能力所特化。一些团体现在正在将新协议商业化，包括无硬件的单细胞系统，但目前还不清楚这些努力将如何丰富生物医学研究和医疗保健市场。
现有的单细胞分析技术
单细胞分析技术的改进可以模糊地表现为对设备或硬件的改进、组织预处理步骤或对核酸富集方法的改变。单细胞协议开发十年来的许多技术现在也被用来加速空间组学技术研究。
最早的自动化单细胞技术之一是由 Fluidigm（现为 Standard BioTools）开发的。该技术使用大规模集成微流体系统，在反应室中一次处理多达 96 个单细胞的裂解物。该系统的设计允许通过由加压阀门系统控制的入口调节反应条件。虽然试剂和仪器费用可能是采用该系统的障碍，但与基于板的检测相比，通量的有限提升构成了采用的更大瓶颈。这一见解促使开发高通量微流体系统，例如由 10x Genomics（Chromium）和 Bio-Rad（ddSEQ）商业化的系统。这些系统使用通过液滴流系统生成的单分散油包水乳液来分离不同隔室中的单细胞，实现高复用能力multiplexing，但自然需要大量的前期成本。较新的技术已经摆脱了固定成本，但每个细胞的成本并没有实质性改变。虽然 Chromium 平台可能会在未来几年内继续使用，因为它具有广泛的功能（Perturb-seq、T 细胞受体和 B 细胞受体测序等）并且广泛用于细胞图谱研究，但目前尚不清楚这种主导地位是否会长期保持。在无需设备的方法中，还没有出现明显的赢家。然而，组合索引combinatorial indexing具有最长的历史先例，Parse Biosciences 和 Scale Biosciences 的解决方案的采用率越来越高。
单细胞 RNA 测序首先使用悬浮状态下的活体全细胞作为输入。然而，处理不同样本类型的需求不断增长，推动该领域开发可以采用不同格式的协议。难以分离的组织（例如神经组织）或在样本预处理后易于快速裂解或转录组改变的组织分析尚未实现。开发了细胞核和新鲜冷冻细胞核的测序协议，最初在培养皿中，然后进行液滴处理。还实施了 RNAlater 等冷冻保存试剂以在单细胞或单核文库制备之前保持组织完整性，确保从采样那一刻起就保存 RNA。虽然核测序的分辨率低于全细胞 RNA 测序，但对于细胞分离困难或细胞结构至关重要的样本有益。单核测序有利于分析复杂组织或保存的样本以了解转录调控；然而，细胞核缺乏成熟的细胞质 mRNA，限制了有关 RNA 剪接的信息。最近，通过改变转录本的捕获方式，可以对福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 样本（最常见的保存临床组织类型）进行分析。
通常，单细胞分析方法通过捕获多聚腺苷酸化 (poly(A)) 读取来富集成熟 mRNA，但会牺牲大量非编码 RNA。在临床样本中已经观察到部分 mRNA 降解，因此基于探针的方法（最显著的比如 10x Genomics Chromium Single Cell Gene Expression Flex）使用反向交联reverse crosslinking和液滴中的靶向逆转录来实现对来自固定组织的高度灵敏的scRNA-seq。该系统的挑战包括试剂盒在小鼠和人类基因组以外的研究中的可用性有限，以及定制面板设计耗时。由于基因型数据在探针结合位点丢失，因此可以使用现成的多路复用试剂盒。非 poly(A) 捕获方法可能具有许多未被重视的优势，包括提高对临床样本中核mRNA前体、非编码 RNA 或降解 RNA 的覆盖率。为了减少对定制探针设计的需求，未来的技术可能会结合随机碱基引发（就像 Parse Bioscience 的 Evercode 平台一样）或人工多聚腺苷酸化读取（注意对酶效率的依赖）；此类修改可能会在 cDNA 序列的选择和扩增中引入变异，从而可能影响结果的准确性和一致性。
空间组学技术可分为基于NGS和基于成像的解决方案。对于基于测序的空间技术，条形码珠子（或像素）已从单细胞基因组学改编而来，并在条形码中包含空间坐标。例如，10x Genomics Visium 平台的早期版本使用 poly(A) 捕获转录本，后来采用了基于探针的策略，将兼容的样本扩大到包括 FFPE包埋组织块。基于成像的技术使用最初为免疫组织化学开发的实验策略，但抗体被寡核苷酸取代。寡核苷酸有时比抗体更有优势——例如，使用 10x Genomics Xenium 系统，原位滚环扩增可改善信号检测。随着时间的推移，拥有相关知识产权 (IP) 组合的公司可能会推出其他解决方案，例如适配体（参见 SomaLogic 的定量蛋白质组学 SomaScan 平台）。
使用这些技术的新兴应用领域
随着公司寻求差异化其技术产品并寻求产品与市场的契合，已经出现了用于评估各种格式（全细胞、固定细胞、细胞核）的单细胞测序质量的指标，例如捕获的细胞数量或每个细胞的唯一分子标识符数量。每个细胞的成本等指标很重要，但考虑到这些方法提供的数据类型和数量存在根本差异，基准测试应主要关注它们在捕获和解释生物学重要见解方面的有效性。我们注意到，不同的技术适用于不同的下游分析流程。随着单细胞和空间组学技术融入药物开发流程并与特定的生物学推断相关联，可以合理地预期，在这种情况下，“产品与市场契合”将演变为“技术与问题契合”。这意味着，一项技术的有效性将通过其与所研究的特定研究问题或分析目标的契合程度和解决程度来衡量。
单细胞技术商业模式趋势
除了直接面向消费者的解决方案外，公司还开发了单细胞和空间组学功能用于内部研究，例如支持药物发现。随着多路复用组学信息可靠性的提高，这些数据也可能被整合到医疗保健系统中。公开市场重视并奖励那些有望成长的公司，因此，在追求用于研究的产品与可能将上述技术用于诊断或临床决策支持工具之间存在着矛盾。
一方面，研究市场主要由政府拨款、早期发现团体和非政府组织资助。因此，前期成本高的硬件可能难以证明其合理性。例如，昂贵的高度多路复用空间组学的性能可能并非在所有情况下都需要，因为存在多种廉价的低重方法，可以应用于连续的组织切片，然后进行计算集成。公司采用的应对这一挑战的一个答案与“剃须刀和刀片”商业模式有关，即以低于其真实价值的价格提供硬件（即平台），以鼓励客户保留，因为随着时间的推移，补充产品（即试剂）会变得异常昂贵。自然地，无仪器系统可能会因此成为一个巨大的市场颠覆者，因为它们减少了现有的市场保护。
另一方面，指导治疗选择的医疗设备可以与昂贵药物的报销挂钩。例如，在肿瘤学中有效使用高成本治疗是一个有吸引力的未来市场机会，尽管实施起来具有挑战性。鉴于监管要求，以及在某些情况下需要进行大规模前瞻性临床研究，临床应用进入市场的过程可能会更加艰巨。
与单细胞技术相关的诉讼趋势
单细胞和空间分析建立在跨跃液滴数字 PCR (ddPCR)、基因组学和微流体技术的复杂知识产权格局之上。与其他竞争领域一样，随着该领域的成熟，诉讼也层出不穷，通常会导致交叉许可协议以确保双方之间的自由经营。
单细胞和空间领域的第一波诉讼涉及基于液滴的微流体系统以及控制和进行其中的生化反应的方法。诉讼涵盖了 ddPCR 和单细胞分析之间的知识产权重叠，以及单细胞分析领域早期创新者之间的知识产权重叠。早期诉讼始于 2014 年，当时 Bio-Rad 起诉 10x Genomics 创始人违反了他们在 QuantaLife（后来被 Bio-Rad 收购）任职期间签订的雇佣和非竞争协议，2015 年仲裁裁决支持 10x Genomics。随后，10x Genomics 和 RainDance Technologies（2017 年被 Bio-Rad 收购）之间又发生了诉讼，Raindance 声称侵犯了六项专利。这场诉讼是在 10x 推出其首款产品 GemCode 之前提起的。在 Bio-Rad 收购 RainDance Technologies 之后，这场诉讼于 2018 年结束，最终裁决对 10x Genomics 不利，禁止销售受影响的产品，并判给 Bio-Rad 2390 万美元的赔偿金。双方之间还发生了其他几起诉讼，包括更多专利诉讼和美国国际贸易委员会投诉。2019 年，10x Genomics 与 Celsee Diagnostics 提起诉讼，声称其侵犯了与其单细胞产品线相关的多项专利。Bio-Rad 随后于 2020 年收购了 Celsee，扩大了与 10x Genomics 的纠纷。到 2021 年，Bio-Rad 与 10x Genomics 的纠纷包括 20 多起独立纠纷，最终通过一项有关单细胞分析的知识产权交叉许可协议得到解决。
其他早期的单细胞技术纠纷也以交叉许可协议告终。碧迪 (BD) 对 10x Genomics（与 BD 于 2015 年收购的 Cellular Research 合作）提起了侵权诉讼，该诉讼于 2019 年结束，10x Genomics 在四年内向 BD 支付了 2500 万美元，并以交叉许可与分子条形码和单细胞分析相关的专利和专利申请而告终。2020 年，10x Genomics 还赢得了对 1CellBio 的纠纷，获得了哈佛大学拥有的知识产权的独家许可。随着 Bio-Rad 和 BD 的大规模诉讼结束，10x Genomics、Bio-Rad 和 BD 能够通过积极的行动自由（交叉许可）方式确保运营自由。
目前正在进行的第二波诉讼涉及现已建立的基于液滴的单细胞方法的竞争对手，包括 Parse Biosciences 和 Scale Biosciences 开发的无设备方法。 2022 年，10x Genomics 对 Parse Biosciences 提起了仍在进行中的诉讼，声称其侵犯了与 Evercode WT 产品相关的专利；2022 年底，Scale Biosciences 也对 Parse Biosciences 提起了诉讼，指控其侵犯了与 Evercode WT 产品相关的专利。由于无设备方法代表了单细胞测序的一个增长领域，并且随着风险投资流入公司，我们预计无设备公司之间以及基于液滴和无设备的公司之间的诉讼将持续存在。
第三波诉讼，也是目前最受关注的诉讼，涉及空间生物学这一新兴市场。2021 年至 2022 年期间，10x Genomics 在欧洲和美国起诉 NanoString Technologies 侵犯专利权。2021 年，10x Genomics 在美国就 GeoMx Digital Spatial Profiler 起诉 NanoString，声称其侵犯了其从 Prognosys Biosciences 获得许可的七项专利，NanoString 提出反诉。2022 年，10x Genomics 在美国提起了另一起与 CosMx Spatial Molecular Imager 有关的诉讼，涉及 10x Genomics 通过收购 ReadCoor 获得的专利。此外，2022 年，10x Genomics 在德国起诉 NanoString 侵犯与 CosMx 产品相关的专利。
2023 年底，美国一家法院裁定 10x Genomics 胜诉，认定 NanoString GeoMx 产品侵犯了 10x Genomics 独家授权的七项专利，并要求 NanoString 支付 3100 万美元的赔偿金。2023 年，10x Genomics 获得了针对 CosMx 产品的欧洲初步禁令——该裁决于 2024 年被欧洲统一专利法院 (UPC) 上诉法院推翻，德国联邦专利法院随后分别裁定 10x Genomics 的一项专利无效。重要的是，NanoString 和 10x Genomics 之间的纠纷标志着通过欧洲 UPC 授予禁令的第一个充分合理的决定，也是欧洲 UPC 上诉法院推翻禁令的第一个实质性决定。
2022 年和 2023 年，Vizgen 还被 10x Genomics 起诉。Vizgen 反诉哈佛大学和 10x Genomics，指控其违反了 NIH 资助提案条件以及反垄断法。NanoString 随后也提起了类似的诉讼。2023 年底，10x Genomics 扩大了其空间生物学法律纠纷，在美国对 Curio Biosciences 提起诉讼，随后又在欧洲提起诉讼。
Vizgen 和 NanoString 的诉讼影响范围超出了单细胞和空间组学。他们挑战了基于公共资助拨款提案附加条件的知识产权独家许可，如果成功，可能会给各个研究领域的其他独家被许可人带来不确定性。这可能会导致独家知识产权向竞争对手开放，从而引发一波新公司的涌现，并将投资者的注意力转移到没有这些知识产权问题的公司。
合并、收购和公开市场
许多单细胞技术源自学术实验室，与特定的知识产权相关。上市公司很少由产品线维持，因此它们需要内部研发 (R&D) 或外部并购 (M&A) 才能发展。10x Genomics 通过积极的收购和诉讼策略确立了自己作为市场领导者的地位。虽然取得了商业上的成功，但这导致竞争减少，并无意中吸引了历史悠久的生命科学公司的兴趣。例如，NanosString 即将破产（由上述法律问题推动），但由于 5 月份被布鲁克公司收购，该公司得以避免破产。最后，虽然交易条款尚未公布，但 Illumina 将通过收购 Fluent BioSciences 进入市场。
从整个行业来看，我们看到单细胞和空间组学初创公司的兴奋之情，10x Genomics 的估值与 Bruker 和 BD 等世代公司相当。即使在首次公开募股之后，上市的单细胞和空间组学公司也是成长型公司，市盈率通常为负，市销率在 2023 年为 5-10 倍，低于 2021 年的 50 倍以上——这一影响主要是受近期利率上升和回归历史估值规范的推动。由于研究市场的规模在很大程度上受药品销售驱动（和制约），这些公司将最适合进入更大的市场，包括医疗器械。可以分析市场中的其他信号——例如，早在上述法律纠纷正式结束之前，NanoString Technologies 的交易价格就低于其现金价值，这说明了市场情绪的预测性。随着我们进入 2024 年，我们可能会看到 10x Genomics 进一步整合空间基因组学市场；然而，即将到来的美国总统大选结果以及新政府对垄断的定义可能会鼓励或阻碍并购活动。
提供单细胞和/或空间组学技术的上市公司的市值以及相关产品发布。y 轴使用对数刻度，以便可以在同一刻度上绘制公司图表。
总结
鉴于定义广泛基因组技术应用的宏观趋势——即美国人均医疗保健成本稳步上升，同时测序成本大幅下降——像 scTrends 这样的举措非常重要。该联盟通过不断用新技术更新其数据库，将严格分析新兴市场趋势和潜在的法律挑战。这些见解至关重要，因为广义的疾病相关表型越来越多地被理解为独特的、可操作的内型，需要精准医疗方法，这些方法有可能提高医疗保健的成本效益。这一不断发展的未来正在由目前正在商业化单细胞和空间组学技术的公司塑造，这些公司大多在研究环境中，但偶尔也用于支持临床决策。这些技术与现代计算的结合对于未来的药物发现和开发至关重要，为目标在临床上提供更大的成功概率。像 scTrends 这样的举措将使我们能够了解药物开发领域如何适应这些变化，帮助阐明这些趋势将如何影响医疗保健的未来以及这个快速发展的领域中各种技术和商业战略的可行性。
原文参考：
https://doi.org/10.1038/s41587-024-02305-0
欢迎转发、分享给更多感兴趣的朋友！！
