在NCM之后，ONT似乎要开启WYMM的巡回宣讲，冲刺下半年的销售，应该不会再有大的技术更新。于是，作为ONT下半年的重点外宣场合，还是有必要来梳理一下ONT在NCM上都更新了啥，作为领头羊的纳米孔测序技术进展到了什么地步。
Not just sequencing, but multiomics
ONT开始更多强调多组学，这不纯是为了迎合行业的发展，本质上纳米孔测序在基因测序之外，也可以对RNA、蛋白等进行直测，妥妥的多组学平台。
从检测基因组变异到全长转录组学、染色质构象和甲基化，从Mb级别的定相到片段组学，ONT平台已经开始渗透分子生物学研究和应用的各个需求。
Gordon Sanghera甚至讲，多组学是第四次工业革命的一个驱动力，第四次工业革命就是物理、数字化、AI和生物学世界的更多融合。
Clive缺席的NCM，产品负责人和开发负责人更新了ONT平台的关键更新，展示了平台准确性、产量和端到端工作流程方面的进展。
ONT平台当前什么水平？配合E8.2.1的马达和R10.4.1的孔，可以实现每秒 400 个碱基的天然 DNA 和 cDNA 测序速度；当前的高精度 (HAC) 碱基调用可提供超过 99% 的原始读取准确度，而 SUP 算法则将其进一步推高至 99.75%（Q26）。随着不断努力改进酶的性能和机器学习完善变异调用，有望实现 Q30 原始读取准确度。
小巧便携的MinION Mk1D将于 2024 年第四季度进入抢先体验阶段，这是MinION产品线自十年前推出早期试用之后的一次重大升级。Mk1D最重要的特征是改进了温度控制。ONT称其经过了严格的测试，即使在冰箱和培养箱等极端条件下也能稳定试用，真正实现其测序的anywhere使命。
机器学习已经开始贯穿整个纳米孔测序的信息学流程，从信号处理和核心工具到变异调用和生物信息学工作流程。最近发布的Dorado v0.8，提高了transformer模型 (SUP) 的速度，并加入了读取完善 (Herro)，可提供 Q40 精度的完善读取以供组装。Oxford Nanopore 的机器学习团队还在持续优化下游流程，从变异检测到 RNA 修饰。许多改进将通过 EPI2ME 实现，从而最大限度地减少对命令行的需求。即将推出的 EPI2ME云将通过本地和基于云的解决方案之间的无缝集成，进一步简化数据分析。
去年NCM以来，ONT加强了对于“使用便利性”的战略推动，更多着眼于E2E工作流程的完善，主要是结合样本制备和信息学的流程来交付完整的工作流程。目前，在其protocol库中已经包括了86个分步操作方案、包含了15条数据分析管线；打包了多条用于合成生物学、人基因组分析、小基因组分析的E2E工作流程。
在此基础上，ElysION这个无需动手、完全自动化的端到端平台系统目前已经处于早期试用阶段，集成了三台 MinION 设备或一台 PromethION 2 Solo 设备（正在开发中），以提供从样本到答案的测序。
在大型队列的E2E上，ONT也公布了他们对人类基因组学的完整方法。从仅使用纳米孔的T2T工作流程到新的高通量条形码工作流程，这些方法旨在使超过 99% 的样本在生产测序环境中达到 30 倍的覆盖率。结合对LIMS 集成，ONT希望达到生产级别的E2E，实现每个流动槽测序多个基因组的能力。
ONT的研发也还在持续改进流通池的产量提升。ONT介绍了新的缓冲条件和酶增强使产量提高了 33%，这使得孔堵塞的概率降低，也减少冲洗和重新加样的次数。开发者模式下，Matt Loose也测试了这一新的流通池化学，在不同的FC上运行了相同的文库（110kb N50），新的缓冲液FC实现了34%的产量提升。新的缓冲流动池目前仍处于研发阶段，只有少数的外部 Beta 测试，ONT预计这些流动池要到 2025 年底才会发布。
除此之外，更高速的马达和上述新的缓冲液结合使用将能进一步提升数据产量，ONT展示了270Gb的单FC无冲洗数据产量。如果实现这种性能的显著提升，最终将减少 T2T 应用中超长读取测序所需的流动池数量，也将助力实现300美元以下的基因组测序。
Not just a sequencer, but a decoder
ONT在直接 RNA 测序上继续升级。自2023年发布最新的 RNA004 化学以来，RNA直接测序实现了更佳的表现，不管是更短的建库时间，更高的产量，还是更高的准确率。
DRS试剂盒 (SQK-RNA004) 的新一代产品能够以更高的准确度和更高的产出量提供天然 RNA 信息。得益于更快的马达（每个 PromethION 流动槽可为人类转录组样本产生约 3000 万个读数），它能够提供更高的产出量，并且得益于新纳米孔和酶组合的改进以及碱基调用器的更新架构，准确性更高。DRS目前可提供 98.9% 的准确率（Q19.4）。
样本制备过程只需不到两个小时，省去了传统上用于准备基于 cDNA 的 RNA 测序工作流程的许多步骤。但还是建议执行逆转录步骤以创建混合 cDNA-RNA 分子，以对天然 RNA 分子进行测序，这里的cDNA 链不会穿过纳米孔，但它有助于在分析时保持 RNA 分子结构的稳定。
ONT平台现在也被开发可以支持 50 个以上核苷酸片段的短读 RNA 测序（之前只有200nt以上的才会被读取）。此外也提供了24重的直接RNA barcoding试剂盒用于multiplexing。
DRS可以实现关键 RNA 修饰（包括m6A、m5C、假尿苷和肌苷）的直接检测，而基准测试表明，在ONT RDS可以有效地单次准确读取这些RNA修饰。
RDS试剂盒与 Dorado 软件工具配合使用还可以估计poly-A 尾长度（研究表明，这一特征是转录后调控的一个重要因素），从而简化流程，而无需求助于第三方算法。
之前也提到过，RDS能够识别 N1-甲基-假尿苷 (m1Ψ)，这是一种常见于市售 mRNA 疫苗中的 RNA 修饰，单次读取准确率为 95%，这直接展示了直接 RNA 纳米孔测序对 mRNA 疫苗质量控制工作流程的潜在效用，并推动了ONT在生物制药领域的战略转向。
Steering towards proteins
上篇文章也介绍了，ONT联合华盛顿大学杰夫·尼瓦拉团队概念验证了ONT平台在蛋白测序上的应用，证明了使用新型马达蛋白通过纳米孔处理多肽的能力，从而实现单个氨基酸读取。而这是通过利用现有的平台实现的，这就意味着无需从头重新设计，就能调整用于实时蛋白纳米孔测序等新领域，为未来蛋白组学的探索应用提供了无限可能。
Nanopore sequencing awaits 2025 highlights
当ONT已经开始放慢创新发布的节奏，当我们开始感觉到这些技术更新已经不是那么炸裂的时候，可能意味着其技术已经差不多成熟了。
在NCM上，出了传统项目微生物病原体宏基因组检测之外，越来越多的报告涉及到使用纳米孔测序技术进行遗传病、肿瘤等的精准检测和诊断。虽然这离Gordon所描述的可产生临床影响力还有一段距离，但事实上ONT技术正在从科学发现、临床研究转入到了临床诊断使用，随着明年可能的第一款纳米孔测序相关IVD产品的获批，这项技术可能将迎来发展的转折点。
科幻作家威廉•吉布森(William Gibson)有一句名言:“未来已经来临,只是尚未流行”。作为可能从使用创新技术中受益的潜在用户来说，如果之前还在怀疑纳米孔测序，那么现在是时候真正地去评估使用它了。
这次NCM上，首次出现了高中生登台演讲，一名16岁的中学学生向众多科学家展示了如何使用纳米孔技术开发现场水质检测，用来解决水污染问题。这不禁让人感叹，借指MinION这样的可及性工具，在完成测序仪进课堂之后，接受了训练的中学生已经可以开始使用它来探索世界了。生物学研究及发现的边界真的在被不断扩大。
ONT 被认为是工业界纳米孔创新开发的先驱，发展到现在这个阶段，面临着从科研工具到临床工业应用的战略转型。ONT一方面为应用市场在提供稳定、锁定的解决方案，另一方面还在持续推动下一步测序技术的进步，包括自适应采样、蛋白测序、手机测序等等。
自然地，我们期待纳米孔测序Q30时刻的到来，期待全长天然蛋白纳米孔测序的产品实现，期待手机测序的推出…
到明年五月份的LC大会还有大半年的时间，ONT似乎把更多的技术更新留到了那个时候展示，似乎也预计到这期间其他公司不会闹出太大水花。
所以，纳米孔测序，2025更精彩？！
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