尽管基因组测序的价格已经在不断下降了，但依然有很多声音认为，测序成本仍然限制了它的使用。所以，持续推动测序成本下降成为创新开发的一个持续动力，永远不过时。
从HiSeq的1000美元基因组时代到现在的DNBSEQ T20/UG100的100美元基因组测序，成本的下降似乎还不够，10美元基因组测序成为一个明确追求的目标。
瑞典公司Single Technologies就正迈步在这条道路上。
Single Technologies（以下简写为Single/辛格）正在开发一种三维测序方法，它相信这可以将每个基因组的耗材成本降低到 10 美元。
Single成立于 2014 年，由首席执行官Johan Strömqvist（约翰·斯特罗姆维斯特）、Bengt Sahlgren（本特·萨尔格伦）、Annika Bolind Bågenholm 和 Raoul Stubbe 共同创立，以斯德哥尔摩皇家理工学院 (KTH) 的单分子成像和生物技术研究以及位于瑞典希斯塔的光纤公司 Proximion 的光纤光栅研发为基础。
Single公司Johan Strömqvist
Strömqvist在攻读博士期间研究的课题是蛋白质-蛋白质相互作用，进行了大量的光学单分子成像工作。他在2010年和其他人联合创立了Apiconisis公司，提供基于荧光光谱的工具，研究不同的化合物如何在活细胞中调节蛋白质-蛋白质相互作用，为决策者提供关于候选药物是否应该进行临床研究的更好信息。光学聚焦是这些应用的关键，但结果是每次测量每个细胞（实际上是每个猪细胞）都需要花费数个小时。因此，使用这种类型的成像设置非常困难且耗时。
在2014 年，Strömqvist与光纤创新者Bengt Sahlgren合作，开始重新思考如何进行三维成像。Sahlgren在北欧最大的光纤公司Hexatronic的崛起中发挥了重要作用，将共聚焦成像提升到一个新的水平。很快他们就想出了一个成像的新想法，因此，Single就诞生了。
起初，在斯德哥尔摩郊区一所住宅的地下室，Strömqvist和Sahlgren开始合作研究蛋白质组学和空间生物学的光学技术。不久之后，他们遇到了一位教授，就是大名鼎鼎的Mats Nilsson，他将挂锁探针和RCA结合开发了诸多创新工具，是直接在细胞中测序 DNA 的先驱（10x Genomics后来收购了他创立的原位测序公司Cartana）。他说服了Strömqvist和Sahlgren进行测序，而不是蛋白质-蛋白质相互作用。
在放弃了使用条形码（如空间基因表达平台）查看多个基因的多路复用方法后，两人开始将注意力转向了原位测序。就在那时，他们意识到可以使用他们开发的光学系统来进行测序，使用3D基质层（matrix）进行三维空间内的大型并行反应。
测序技术的演变从最初的凝胶发展到毛细管电泳，再到微阵列和基于流通池的高通量测序，实现了从一维到二维的进化。这其中，技术的小型化对于降低成本和提高这些系统的通量确实至关重要。通过降低试剂成本、提高测序速度、提高测序效率和提高填充密度，基于微阵列测序的成本在 10 年内呈指数级下降。如今，测序环节的大部分成本都集中在耗材上，即试剂和流动槽。
Single所讲的3D 测序正在从单个表面上的簇测序转变为三维空间体积中的簇测序。在二维表面上测序时，大多数试剂都不会在流过时被使用。如果在三维立体中组装簇，理论上可以更有效地使用相同的试剂，本质上是以相同的试剂成本测序更多的 DNA 碱基。
由于光学分辨率限制，在 NGS 中，如果这些簇离得越来越近，就无法真正地从光学上进行区分，而3D 处理可以克服这种限制，这也是可以在每个体积中使用更多簇的原因之一。
但是，最终这需要一个非常快的成像扫描仪才能在三维空间中分离这些簇。而现在的3D扫描系统太慢了。如果Single的概念要在三维空间内中实现，他们就必须开发足够快的扫描仪，速度必须提高上千倍。这正是Single团队所擅长的光学系统开发和创新。
自2019年以来，Single一直致力于在开发这样的高通量测序仪器，他们称其为Theta。
Single利用已成熟验证的SBS边合成边测序方法，在测序化学上没有进行额外的创新。即便如此，如上述概念所提示的，推出专利的Theta 3D测序仪之前，Single还需要先完成几个方面的创新。
首先就是3D的流通池和相应的流体系统。
传统的2D流通池是双表面、图案特征化或随机排布的，而3D测序将不再局限于表面和通道，而是按体积而不是面积进行分析。因此3D流通池允许DNA或RNA能够高效地分布在一定体积内，流体系统可以在三个维度上交换液体和试剂，允许大量液体快速分配并有效地使用高值的试剂。同样，不同于传统2D流通池的固相扩增成簇，3D测序需要在立体空间中实现扩增，Single所谓的Volumetric amplification。
Single在网页上称其为3D基质层（英文matrix），根据其申请的专利，该基质层“可能包含凝胶，例如水凝胶”，并且可以应用于可旋转表面。该应用建议采用圆盘或圆柱体，但有报道称Single目前正在使用环形或甜甜圈形状作为可聚合凝胶基质，使用线性坐标系，并将样品视为矩形体积，而且在基质厚度方面很灵活，根据应用有不同的最佳基质厚度。
流通池之外，另一个就是开发高速共聚焦扫描仪，能够在光学分辨率极限下以单个荧光分子灵敏度在三个维度上对大面积区域进行成像。
本质上，突破扫描速度的极限对于整个测序届来说都至关重要。Illumina等公司也进行过大量探索，但由于速度问题，最终选择使用TDI线扫。Single最初的开发目标是比共焦成像快 800 倍。Strömqvist最近声称已经实现了这一目标，现在的目标是构建一个速度提高 3,000 倍的系统。
这样一来，按体积运行，每次读取次数将增加很多倍，对于数据处理的需求有可能指数增加。Single称，每次运行产生的图像数据被传输到服务器解决方案，其中独特的 3-D 碱基调用算法和机器学习可识别正确的碱基并对齐读取。生成的测序数据以标准化 FASTQ 文件的形式存储。
Theta测序仪将比 Illumina NovaSeq小，但重量接近 300 公斤，占用空间约 1 立方米，设计用于生产规模实验室。Single现在拥有至少一个原型，在过去两年中Single使用这一原型生成了数据，并且正在建造另外两个商业系统，这些系统应该在2025年初准备就绪。
最终，使用Theta测序就像现在大多数测序一样，从一个典型的、Illumina类似文库开始，通过三维的基质层分布固定所有的文库DNA，进行上机，运行SBS 化学进行测序。最后，每次运行会生成一个 FASTQ标准化文件，可进行后续的分析。本质上，Theta测序的质量应该和现行的标准NGS测序没有太大的差别。
Strömqvist称，第一个应用可能是基于测序的计数应用，希望能够在 Q30上可靠地进行这类应用的测序。公司目前正在进行数十亿次读取，在不久的将来，有机会实现万亿次读取。
事实上，随着从平面转移到三维立方体，Single自然而然地将测序与空间生物学结合起来。Single独特的流通池架构可实现三维空间的大规模并行反应，同样，3-D 测序不仅限于片段文库，还可以兼容细胞或组织，因此可以使用同一平台对单个细胞和组织中的不同分析物进行测序。这种独特的能力为空间多组学研究打开了大门。
自 2019 年开始研发 Theta 3-D 测序仪以来，Single通过债权和股权融资相结合的方式共筹集了约2000万美元。值得一提的是，Single拥有名人密集的股东名单，其中包括瑞典著名企业家Carl-Henric Svanberg（曾任爱立信CEO、英国石油董事长，现任沃尔沃董事长）、在线赌场公司 Evolution Gaming 的创始人Jens von Bahr、Spotify前CTO Andreas Ehn、动物保健公司Anicura 的创始人Peter Dahlberg和PEA/Olink等多家生物技术公司的联合创始人、大名鼎鼎的Ulf Landegren教授。此外，KTH Holding 和 Almi 也在股东名单上。目前，Single正在筹集新资金，预期在今年下半年完成。
除了Ulf Landegren之外，著名基因组学的先驱、前 Illumina 高管Bob Kain也加入了Single担任顾问。Kain最为出名的或许是他在 1999 年至 2014 年期间在 Illumina担任首席工程官的工作。在此期间，他不仅帮助Illumina从一家拥有 30 名员工的初创公司成长为年收入超过 15 亿美元的商业巨头，而且还帮助发明和商业化了第一台现代高通量基因组测序仪HiSeq。Kain认为，Single的3-D测序是他在HiSeq之后见过的第一个真正具有颠覆性的架构，而且Single团队已经解决了可能会想到的障碍。
Single计划于 2025 年第一季度开始亮相提供服务，在2026 年创建一个可能有五台机器的抢先体验系统。但在此之前，他们首先要确定系统的稳定性和可靠性，因此还需要再进行开发。一旦按下最终生产系统的按钮，他们可能还需要一年到一年半的时间才能拥有一个可以置于外部的可用系统。
三年后，我们就将迎来十美元的基因组测序？！
祝福Single能够成功。
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