基于纳米孔的基因测序已经比较成熟了，牛津纳米孔技术公司（ONT）将这种方法用于DNA及RNA的直接测序已经取得了成功；纳米孔生物传感通常利用分子通过孔隙时产生的电流变化来确定其身份，基于这一普适原理，在基因测序之后，学术界和产业界都在探索纳米孔蛋白测序分析的应用。
在过去的几年中，全球各地不同的研究小组都相继发表了一些研究成果，证明可以通过受控的方式将全长蛋白质移动通过纳米孔，并根据其所产生的特异信号进行氨基酸/肽段或翻译后修饰识别的可行性。（另参考：当纳米孔蛋白质测序遇到单细胞蛋白质组学...）
GenomeWeb最新的一篇评论文章更是主题鲜明地指出，尽管仍存在技术障碍，但基于纳米孔的蛋白质分析已接近可行性；学术界和产业界的研究都展示了应对这一挑战的潜在解决办法，而且荷兰的一家公司Portal Biotech已经开始将基于纳米孔的蛋白质分析仪交到早期采用者手中。
可以说，基于纳米孔的蛋白组学已经走到了历史的重要拐点。
GenomeWeb的这篇文章相对全面地评述了这一领域的进展，接下来我们就转述总结一下。
与核酸测序相比，基于纳米孔的蛋白质分析难度要大得多。蛋白分析必须应对 20 种氨基酸，而 DNA 中只需要考虑 4 种碱基，此外还要应对大量的蛋白翻译后修饰PTM，而更大的一个挑战是，在将蛋白质通过纳米孔之前，必须以足够的控制和一致性展开蛋白质的三维结构，以产生可重复的信号来识别蛋白质。
但基于纳米孔的蛋白质分析的优势也非常大，因为它可以以单分子灵敏度对全长蛋白质进行详细分析，而这是目前使用质谱或免疫测定等其他蛋白质组学技术无法实现的。
所谓的纳米孔蛋白分析技术可能被划分为两种，一种是基于纳米孔的蛋白质指纹识别，其中纳米孔不是用来读取氨基酸序列，而是用来生成蛋白质特有的“指纹”信号，通过这样的技术可以来识别蛋白质身份，也可以使用与预期信号的偏差来识别其序列或翻译后修饰中的潜在变异。另一种是使用纳米孔进行真正的从头测序（在蛋白质通过纳米孔时读取蛋白质中的每个氨基酸）。相比指纹识别，从头测序的挑战更大，可能出现会在指纹识别技术之后。
几位活跃在纳米孔蛋白测序领域的科学家
应对易位过孔挑战
不管是指纹识别还是测序，如何让目标蛋白通过纳米孔都是关键。
广义上讲，易位策略可以分为两类：酶促策略，其中使用 DNA 解旋酶或蛋白质展开酶 ClpX 等酶来转移蛋白质；非酶促策略，其中使用电泳或电渗流等物理力来转移目标蛋白。
在去年发表于《自然纳米技术》杂志的一项研究中，牛津大学化学生物学教授、ONT公司创始人之一哈根·贝利（Hagen Bayley）领导的团队介绍了利用电渗透法进行纳米孔蛋白质分析，该过程利用纳米孔对液体中的特定离子进行选择性分析。当对纳米孔施加电位时，它会将这些离子拉向纳米孔，这些离子会携带水分子，而这种液体流动可用于展开蛋白质并使其通过纳米孔。
贝利教授认为电渗透是蛋白质转运“最有前途的方法”，并指出用于纳米孔 DNA 测序的酶促工具不一定适合蛋白质分析。非酶促方法也可能比基于酶的方法更简单，因为它需要对目标蛋白质进行更少的操作。
伊利诺伊大学香槟分校物理学家阿列克谢·阿克西门蒂夫 (Aleksei Aksimentiev)（他的研究工作包括基于纳米孔的生物传感）强调了贝利实验室和其他实验室对电渗透力应用是该领域的一个重要进展，因为在此之前，尚不清楚这种力是否足以让蛋白质穿过纳米孔。
但他也指出，电渗透方法存在一些困难，特别是在控制蛋白质通过孔的一致性方面，这种一致性可能随孔的长度而变化，并取决于特定时间通过孔的蛋白序列的电荷。尽管单靠电渗透力就足以用于指纹识别，但他认为酶促方法可能更好，因为其可以提供更一致的移位。
在酶促方面，ONT公司和包括 Aksimentiev 和代尔夫特理工大学研究员 Cees Dekker 在内的团队分别探索了将 DNA 与目标蛋白质连接起来，然后使用 DNA 解旋酶将蛋白质-DNA 复合物拉过纳米孔的策略。然而，这种方法的一个潜在限制是读取长度，目前能够使用该技术只能观察 20 到 30 个氨基酸范围内的肽段。
于是，将酶促和非酶促方法结合起来可能是一个解题思路。本月，华盛顿大学分子工程学教授杰夫·尼瓦拉 (Jeff Nivala) 领导的研究小组在《自然》杂志上发表了一项研究，他们利用电泳法将蛋白质拉过纳米孔，然后用 ClpX 以更慢、更可重复的方式将其从孔中拉出，从而产生更好的信号来识别蛋白质并检测氨基酸变体和 PTM。
Nivala 认为这种酶马达将是通过纳米孔转移蛋白质的关键，因为如果没有马达，就无法实现可重复性，无法控制链的移动方式。
纳米孔蛋白质分析公司 Portal Biotech 也采用了一种组合方法，将电渗力与纳米孔结合起来，纳米孔经过设计，包含一个蛋白酶体，以展开和转运目标蛋白质。该公司联合创始人兼首席科学官、格罗宁根大学化学生物学教授乔瓦尼·马格利亚 (Giovanni Maglia) 小组于2021 年在《自然化学》上发表了一篇论文，介绍了他们设计并用于蛋白质测量的纳米孔-蛋白酶体复合物，随后在2023 年又在《自然生物技术》上发表了一项关于利用电渗流展开和转运蛋白质的研究。Portal Biotech 联合创始人兼首席执行官 Andrew Heron（他之前曾担任ONT高级研究总监，也参与了ONT蛋白测序方面的开发）认为这种力量的结合使得能够以“几乎节拍般的精度”将蛋白质通过纳米孔。
指纹识别的近期应用潜力
随着控制展开和易位的进展，该领域已更接近能够进行有意义的蛋白质测量。
目前，这些是指纹测量，通常以有针对性的方式针对一组蛋白质或肽而开展，这些蛋白质或肽通常是纯化的或合成的。
基于纳米孔的蛋白质指纹识别可能能够提供使用质谱等方法难以获得的信息，如可以识别和定位多种 PTM 或其他改变。利用质谱比较难识别多个修饰位点中具体哪些被修饰了，但肽穿过纳米孔产生的顺序特异信号就可以可靠地识别这些被修饰的不同氨基酸。
在最近发表在《美国化学会志》上的一项研究中，Bayley 和同事使用特定于蛋白质磷酸化的化学结合剂 (phos-tags) 进一步区分这些修饰产生的信号，从而使他们能够检测沿着 700 多个氨基酸的多肽链的磷酸化状态。
基于纳米孔的蛋白质指纹识别已经可以用于研究一组明确的蛋白质靶标，比如确定特定肽或蛋白在确定位点是否存在特定的修饰。使用实验生成的纳米孔数据与针对特定蛋白质而建立的更大的纳米孔数据库进行比较，可以将这项技术扩展到更广泛的指纹识别领域。
另一方面，反过来看，Nivala小组最近的《自然》论文证明了可以根据与蛋白质实际实验信号相匹配的氨基酸序列预测纳米孔信号。设想将来，通过给定蛋白质的序列预测其产生的纳米孔信号，并通过将实验生成的纳米孔信号与预测信号进行匹配，也可以用来进行蛋白的识别，这就像在质谱中所做的那样。
Portal Biotech公司一直在利用其实验性纳米孔数据来训练机器学习算法，以预测来自蛋白质序列的纳米孔信号，目的是生成可用于识别的模拟信号数据库。公司定期测量 100万道尔顿以上的蛋白质以产生特定的纳米孔信号，因为与测量较短的肽相比，测量这种大蛋白质的一个优势是它们的标记非常独特，更容易识别。Portal的CEO表示，公司现在已经能够生成此类模拟数据库，并从数千种潜在候选物中识别出单个蛋白质，准确率可超过 90%。
从头测序还有不小挑战
真正的蛋白质从头测序需要识别 20 种氨基酸中的每一种（还要包括它们的 PTM）。这其中的挑战在于，当蛋白质通过纳米孔时，会有多种氨基酸同时与纳米孔相互作用，产生难以解卷积的高度复杂信号。
解决这个问题的一个可能方法是降低潜在氨基酸组合的复杂性，例如，利用不同氨基酸的不同电荷状态等特征来缩小可能存在的氨基酸的范围，从而减少组合空间的大小。
而另一方面，化学方面的创新，尤其是纳米孔设计方面的创新必不可少。较浅的孔径可以同时容纳较少的氨基酸，比如设计限制较少氨基酸（可能在两三种左右）的纳米孔，这可能是简化信号以实现基于测序的方法的关键。
此外，另一种可能的选择是从目标蛋白质中一次切下一个氨基酸，然后将它们单独送入纳米孔。但问题在于必须捕获所有氨基酸，并按顺序捕获它们，这个挑战并不小。
除了改进纳米孔技术，还需要训练和构建越来越好的机器学习算法。这些都还需要不少的持续努力。
商业前景逐渐展现
迄今为止，基于纳米孔的蛋白质分析基本上还停留在学术阶段，商业参与者迄今未能将产品推向市场。
法国公司DreamPore于 2017 年成立，旨在开发纳米孔蛋白质分析系统，但该公司目前似乎处于不活跃状态。2018 年，德克尔和他的代尔夫特同事 Chirlmin Joo 创立了一家名为Bluemics的公司，旨在将他们实验室开发的基于纳米孔的蛋白质检测技术商业化，但由于难以找到投资者，他们关闭了该公司。
2021年成立的Portal Biotech 似乎相对前景乐观一些。公司在 2022 年筹集了 1100 万美元的风险投资，已经开始向早期采用者提供仪器，包括从学术实验室到大大小小的生物制药公司。公司也在分析外部客户发送的样本，不断完善软件和功能，持续改进以适应客户的特定应用。
ONT公司还继续致力于将其技术应用于蛋白质分析。公司仍在努力“建立制备能够以统一方式穿过纳米孔的全长蛋白质的方法”，并且“氨基酸调用仍具有挑战性”。ONT公司的最终目标是从头测序，但也打算“开发特定应用的产品和方法，以实现蛋白质指纹识别”。Nivala 的部分研究成果（包括最近发表在《自然》杂志上的研究成果）部分由 Oxford Nanopore 资助。在研究中，他们使用了ONT的 MinION 平台进行测量。
与单分子蛋白质分析领域的其他参与者（例如 Quantum-Si 和 Nautilus Biotechnology）一样，纳米孔可能首先会用于相对狭窄目标的应用，比如，首先进入靶向蛋白质组学领域，这里很容易获得（感兴趣的）蛋白质或有限的蛋白质库。尽管如此，这对于药物开发领域也将有不小的推动，例如促进对药物生物标志物或靶标的深入表征，或者就生物制剂而言，促进对药物本身的深入表征。
从长远来看，随着技术的不断进步，基于纳米孔的蛋白分析技术将对“深度发现”的蛋白质组学变得更加有效。
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