中枢神经系统（CNS）肿瘤是最致命的癌症类型之一，手术切除通常是治疗的第一步，手术必须在最大限度切除肿瘤和最小化神经损伤及并发症之间取得平衡，这对于神经外科医生存在巨大的挑战。然而，外科医生在手术前对确切的肿瘤类型了解有限，目前使用的标准方法是进行术前成像和术中组织学分析，但这些方法耗时较长（术后一周）且并不总是能得到正确的判断结果。
基于DNA甲基化谱对CNS肿瘤分型的有效性已得到了较广泛的研究认证。然而，当前基于甲基化芯片的分析方法时效性不强，且一般需要单次检测大量样本来满足经济效益，无法满足临床上实时、快速、甚至在手术期间按需完成分型的需求。基于纳米孔测序的甲基化谱分析可以实现CNS肿瘤实时分型，以支持个性化的术中神经外科治疗决策。
本期小编带您了解纳米孔测序技术在CNS肿瘤分型中的应用。
文献一
术中超快速深度学习中枢神经系统肿瘤分类
作者：
C Vermeulen, M Pagès-Gallego, L Kester
DOI：10.1038/s41586-023-06615-2
解读
近年来，DNA甲基化谱已成为帮助区分肿瘤亚型的有力工具，但其分析方法通常需要至少几天。纳米孔测序能够直接测量甲基化胞嘧啶，大大缩短样品制备时间，因此，可以在手术早期阶段将组织样本送去测序，以便及时获得分子诊断，从而影响和制定神经外科策略。而术中使用纳米孔测序时，鉴于手术时间的限制，只能生成“极其稀疏”的甲基化信号。
该研究报道了一种名为Sturgeon的深度学习工具，该工具结合了纳米孔实时测序技术，经过优化可以使用稀疏数据，实现在手术过程中对中枢神经系统肿瘤进行分类。在50个回顾性中枢神经系统肿瘤样本的稀疏纳米孔测序数据中，Sturgeon可以在20~40分钟内对45个样本做出准确诊断。在25例真实的术中场景中，Sturgeon诊断周转时间不到90分钟，其中18例（72%）诊断正确，大大缩短了从活检到确定肿瘤的时间。
图1.术间测序周转时间
相比于其他方法，本研究中的Sturgeon工具可以实现在20~40分钟内实时了解肿瘤类型，并将从活检到确定肿瘤的时间缩短到60~90分钟，使得外科医生能够在手术过程中根据肿瘤的具体特征调整手术方法和手术技巧成为可能。
文献二
使用纳米孔测序对脑肿瘤进行基于甲基化的稳健分类
作者：
Luis P. Kuschel, Jürgen Hench, Stephan Frank
DOI：10.1111/nan.12856
解读
DNA甲基化是细胞身份的稳定表观基因组标记，已成为组织肿瘤诊断的强大工具。将监督式机器学习应用于全基因组DNA甲基化谱，可以对未知样本进行分类，可与组织形态学分类方法形成互补，目前该种方法已被广泛应用于脑肿瘤、软组织肉瘤和原发灶不明癌症的分类。然而，当前基于甲基化芯片的分析方法时效性不强，且成本较高。
该研究基于低通量纳米孔测序，结合5mC和CNV谱，开发了基于机器学习的针对82种脑瘤分型的特定算法。研究表明该种方法能够区分大多数原发性脑肿瘤。研究使用了82个不同肿瘤实体的公共数据，对涵盖46种脑肿瘤（亚型）的382个组织样本进行了纳米孔基因组测序。通过在55个病例的队列中进行抽样，使用随机森林算法确定了高置信度分类最少随机CpG特征数为1000。引入分类得分校准作为临床应用的可信度指标，并确定了特定于该平台的阈值（>0.15）。在独立验证队列中，该阈值可实现100%的特异性，同时灵敏度达到80.4%。跨实验室验证表明,该方法具有良好的稳健性，4个实验室间10/11例（90.9%）结果一致。在前瞻性基准测试中，从获得组织到结果返回手术室的中位时间为21.1小时，手工操作时间平均146.5分钟。
图2.纳米孔测序的基准测试和实验室内周转时间。随时间推移、随着测序数据量的增加，分类结果的准确性和置信度不断提高。在90分钟内，分类准确率达到100%。在前瞻性基准测试中，从获得组织到结果返回手术室的中位时间为21.1小时，手工操作时间平均146.5分钟。
图3.纳米孔分型方法比SSO方法存在更少的分型歧义
纳米孔测序可实现在较短时间内对脑肿瘤谱进行稳健和快速的基于甲基化的分类，不仅可以缩短诊断时间，还可增强神经病理学决策并提高诊断精度，为临床实施提供了可靠的依据，该种方法有望大大缩短诊断周期，支持术中治疗决策。
文献三
脑肿瘤术中DNA甲基化分类影响神经外科手术策略
作者：
Luna Djirackor, Skarphedinn Halldorsson, Pitt Niehusmann
DOI：10.1093/noajnl/vdab149
解读
肿瘤实体的精确诊断对手术策略的选择至关重要，目前，手术决策依赖于术前影像学检查和术中冰冻切片病理学评估，但这种方法存在时间延迟和诊断错误的问题，特别对于一些诊断困难的肿瘤亚型，冰冻切片病理学诊断可能受到肿瘤位置、生长模式、细胞密度低以及活检样本量小等因素的影响。机器学习算法可以利用甲基化特征对肿瘤进行亚型分类，相比传统方法更加稳健和敏感，但通常需要较长的分析时间。
本研究建立了一种基于纳米孔测序和机器学习的快速DNA甲基化分析方法（NDMA），以在手术决策所需的时间内提供准确的肿瘤分类结果，从而支持个性化的手术策略选择。使用NDMA对来自6个群体的105个临床研究样本的分析中，其中93例（89%）与神经病理评估一致，并且对6例病理学无明确结论的样本也做出了正确的分类。NDMA对20个手术过程中获取的活检样本进行分析后，优化后的NDMA从取样到反馈结果的时间为91~161分钟，平均30分钟内就能获得至少3500个CpG位点的甲基化数据，足以进行准确的肿瘤亚型分类。在20例手术病例中，有12例（60%）NDMA分类结果可能会影响手术策略的选择，对于某些诊断不确定的病例，NDMA分类结果会支持进一步手术切除，而对于某些预后良好的肿瘤亚型，NDMA结果可以避免过度手术切除。
图3.NDMA可以对脑肿瘤进行详细、快速的分类
图4.术中NDMA可影响神经外科策略
综上，NDMA是一种快速、敏感、稳健的脑肿瘤分子诊断方法，可以在手术决策所需的时间内提供准确的肿瘤亚型分类结果，从而支持个性化的手术策略选择，改善患者预后。这种技术有望在未来广泛应用于脑肿瘤的精准诊断和治疗。
