免疫组化的定义
IHC是组织样本的常规形态学诊断之外的重要辅助检测工具。IHC能提供与疾病的状态和生物学相关的重要诊断、预后、预测信息。
抗原
抗原能激发抗体形成并与抗体相结合。
抗原通常为大分子量的蛋白质或者糖蛋白。
抗原上能与抗体发生特异性反应的位置称为表位或者抗原决定簇。
1. 抗原决定簇（AD）：抗原中能与一抗结合的部位；
2. 由5-8个氨基酸或碳水集团组成的短序列；
3. AD可以是一段蛋白质序列（一级结构），或不连续的蛋白质三维结构；
4. 某些AD是某种抗原独有的，某些AD可出现在多种抗原中—抗原的交叉反应；一个抗原可由多个AD，这就是抗体不同克隆号的由来。
抗体
抗体是机体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反映的免疫球蛋白。
抗体能够被分为五种主要的类别: IgG, IgM, IgA, IgD和IgE。
它们由B-细胞 (B-淋巴细胞)产生，防止外来物质，比如细菌、病毒等的入侵。
免疫组化最常用的是IgG和IGM。
1. lgG是球蛋白单体，分子量大约为16万～18万。在血清和体液中浓度最大，约占免疫球蛋白含量的70～80%，50%分布于血浆。在机体受到抗原初次刺激后，IgG迅速产生，速度仅次于lgM。 2. lgM是由5个球蛋白单位组成的五聚体，在血清中的含量仅次于lgG，分子量大约为90万，是体内最大的球蛋白。IgM占血清Ig总量的5%～10%，血清浓度约为1mg/ml。在抗原初次刺激机体后，lgM出现速度最快。
抗体结构：Fab“手臂”和不变的Fc“尾巴”
抗体分类：多克隆抗体 vs. 单克隆抗体
1.多克隆抗体
简言之多克隆抗体是单克隆抗体的混合物，是由多种抗原决定簇刺激机体所产生的，相应地就会产生各种各样的单克隆抗体。这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体；
最常用的动物是兔子，其他还使用的动物包括山羊、猪、绵羊、马等；
优选兔子的原因:
多克隆抗体产生的流程：
多克隆抗体的优势：
1. 敏感性高，特异性低：因为这种混合群体可以与同一抗原上的不同表位相互作用，如果抗原的一个表位被破坏，可以与其他可用的表位结合;
2. 抗体更的稳固，效价更高；
多克隆抗体的劣势：
1. 由抗体混合产生的;
2. 批间差异;
3. 由于与其他有相似表位的其他抗原发生交叉反应而引起的背景染色;
2.单克隆抗体
是由单一B细胞（浆细胞）产生的具有免疫化学特异性并与抗原的特异性决定簇反应的抗体，简单来说就是高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。
小鼠、兔子是目前最常用的生产单克隆抗体的动物。 单克隆抗体产生的流程：
单克隆抗体的优势： 1. 特异性好 2. 减少与靶以外抗原的交叉反应
3. 不存在批间差
4. 无限供应
一抗 vs.二抗 vs. 信号增强液
1.一抗：Primary Antibody
一抗：一种免疫球蛋白，能特异性结合特定抗原并对其进行纯化和测量。
2.二抗：Secondary Antibody
二抗：能直接与靶抗原连接的一抗结合，即抗体的抗体；
二抗可与一抗特异性结合，并可以直接带有显色标记(如带荧光、放射性、化学发光或显色基团）或者结合显色标记物；
二抗的主要作用是检测一抗的存在，并将一抗的信号放大并显色。
3.信号增强液：Linker
在免疫组化中，信号放大的方法有很多。其中可以是一种动物（通常是小鼠或兔）免疫球蛋白，用于与标记在一抗上的标记物形成复合物再结合多个二抗分子以达到信号放大的目的；
信号增强液是像一个“饼干夹心”增加一抗和二抗的结合位点；
通常这种信号增强液可以放大4-5倍的信号。
一图掌握不同抗体公司的一抗、信号增强液、二抗的结合位置及步骤
如何选择抗体？
大家是不是开始进入“混沌”状态？一抗怎么选？二抗怎么选？接下来进入Tips阶段：
一抗选择建议
从选择应用的角度：根据所做实验类型选择抗体。
从样本种属的角度：
1. 根据所做样本类型选择合适的抗体，如，反应对象：Human, Mouse, Rat。
从抗体的类型或种属：
1. 单抗和多抗的选择：单抗和多抗优缺点不再赘述。一般如果是应用于临床，尽量选择单抗。
2. 种属：多抗一般是兔子，单抗的话兔或小鼠都有。
1）选择兔子还是老鼠，要看实验室及提供抗体的选项；
2) 有文献报道，兔单抗亲和力是小鼠单抗的10-100倍。
3）亲和性高的优点显而易见。不过对于高亲和性的抗体，需要注意的是如果实验室环境例如干燥，实验操作导致干片或抗原修复等问题高亲和性抗体出现非特异染色的几率也高。
目标蛋白的结构区域
1. 这个在特定科研环境需要考虑待测蛋白的状态，例如：全长蛋白、蛋白质片段、多肽等。
2. 对于待测蛋白有额外的提取或处理要求，例如，有些抗体仅能识别已还原和变性的蛋白质（蛋白质折叠形成的二级或三级结构中被隐藏的表位)；有些抗体仅能识别天然、折叠状态的蛋白质。
二抗选择建议
从样本种属的角度：
1. 二抗的选择主要根据一抗种属来源来决定，若一抗是鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗；
2. 若实验中选用信号增强液（Linker），则根据信号增强液的种属来源来决定。
二抗的偶联标记物：
1. 临床诊断的时候，主要使用的商品化的HRP二抗，所以不存在需要考虑选择偶联标记物的情况；
2. 科研的时候，选择何种二抗取决于具体的实验要求。偶联标记物包括：
1）酶类标记（如 AP、HRP…）
2） 荧光标记（如 FITC、PE、Cy7…）
3） 其他标记（如 Biotin…）
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