mIHC/IF染色流程2
1. 抗体选择和标记：选择特异性强、交叉反应低的抗体。每种抗体可以结合不同的荧光染料或酶标记物。
2. 染色过程：将多个抗体按顺序或同时应用于组织切片。荧光染料或酶标记物可以通过不同波长的光或化学反应显现出来。
3. 信号检测和分析：使用荧光显微镜或其他成像设备对组织切片进行成像，通过不同波长的光源或化学反应检测多种标记物的表达。
光镜多重免疫组化连续单玻片染色(MICSSS)
染色平台2
mIHC可以通过一次添加多个标记物到载玻片（如Ventana RocheTM或Biocare MedicalTM)，或者通过循环染色步骤的方法来实现。
mIF技术有多种平台，包括标准IF可支持4-5个复合分析，以及6-8个复合分析的多光谱技术(Vectra 3.0TM/ polarism)。
高阶复合方法包括飞行时间多路复用离子束成像(MIBI-TOF)、成像质谱细胞分析(IMC)和数字空间分析(DSP)等。这里将讨论支持这些不同方法的基本原则，以及每种方法的优缺点(见表1)。
mIHC和mIF的实践应用
1. 癌症研究和诊断：
1）肿瘤微环境研究：在癌症研究中被广泛用于分析肿瘤微环境中的各种细胞类型，如免疫细胞、基质细胞和肿瘤细胞。通过多重标记，可以更深入地了解肿瘤的免疫逃逸机制和病理特征。
2）个性化治疗：帮助识别患者肿瘤中具体的生物标志物，从而制定个性化的治疗方案，提高治疗效果。
2. 免疫疗法评估：
1) 疗效监测：用于评估免疫疗法的疗效，通过检测治疗前后肿瘤微环境中的变化，判断治疗效果。
2) 预测治疗反应：检测患者样本中的生物标志物，预测患者对特定免疫疗法的反应，为临床决策提供依据。
3. 药物开发
药物筛选和验证：
1) 高通量筛选：药物筛选中用于评估候选药物对多个标记物的影响，提高筛选效率。
2) 药效评估：在药物开发过程中，用于验证药物在体内外模型中的效果，帮助优化药物设计。
4. 毒性研究：
1) 多重标记分析：用于毒性研究，通过多重标记检测，评估药物对不同细胞类型和组织的影响，确保药物的安全性。
5. 基础研究:
细胞生物学和发育生物学
1) 细胞间相互作用：在细胞生物学研究中用于分析细胞间相互作用和信号传导途径，通过多重标记检测细胞内外的变化。
2) 组织分化研究：在发育生物学中，用于研究组织和器官的发育过程，通过检测多个发育标记物，揭示发育机制。
神经科学：
1) 神经网络研究：在神经科学中用于研究神经元和胶质细胞的分布和功能，通过多重标记检测神经网络的结构和活动。
2) 神经退行性疾病研究：用于分析神经退行性疾病中的病理变化，帮助理解疾病机制并寻找潜在治疗靶点。
mIHC/mIF的产品6
以下是几家在多重免疫组化（mIHC）领域取得显著成功的公司及其相关产品：
1. Akoya Biosciences
产品：Opal Multiplex IHC Kits
特点：Opal试剂盒允许在单一组织切片上同时检测多个蛋白质标记物。它使用荧光染料和特定的抗体，提供高灵敏度和特异性的检测。
应用：广泛应用于肿瘤微环境研究、免疫疗法评估和基础研究。
2. PerkinElmer
产品：Phenoptics Quantitative Pathology Research Solutions
特点：包括Vectra Polaris成像系统和inForm图像分析软件，提供多重标记物检测和定量分析。
应用：用于癌症研究、药物开发和病理学研究，帮助揭示复杂的生物学过程和疾病机制。
3. Roche Diagnostics
产品：VENTANA Multiplex IHC Assays
特点：提供全自动化的IHC染色和多重标记物检测，确保高通量和高重复性的结果。
应用：广泛应用于临床诊断、肿瘤研究和个性化医疗。
4. Cell IDx
产品：UltraPlex Multiplex IHC Kits
特点：提供多重标记物检测，结合高灵敏度和快速检测能力，适用于FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）组织样本。
应用：用于免疫监视、肿瘤微环境研究和临床研究。
5. Bio-Techne (through Advanced Cell Diagnostics, a Bio-Techne brand)
产品：RNAscope Multiplex Fluorescent Assays
特点：RNAscope技术结合mIHC和RNA原位杂交，允许同时检测RNA和蛋白质标记物
应用：在基因表达研究、肿瘤生物学和药物开发中广泛应用。
6. Thermo Fisher Scientific
产品：Invitrogen Multiplex IHC Kits
特点：提供各种多重IHC试剂和配套的检测平台，确保高灵敏度和特异性。
应用：用于基础研究、临床前研究和病理学分析。
mIHC/mIF面临的技术和运用的挑战2-4
1. 抗体选择和特异性
1) 抗体特异性：选择具有高特异性的抗体是关键，以确保每个抗体只结合其特定的目标蛋白，避免非特异性结合。
2) 抗体优化：不同的抗体可能需要不同的染色条件（如孵育时间、温度、pH值等），优化这些条件以确保最佳的染色效果。
2. 抗体交叉反应
1)交叉反应：多种抗体同时应用时，可能会出现交叉反应，即一个抗体与非目标蛋白结合。这会导致误判和错误数据。
2)多重染色顺序：选择合适的抗体应用顺序，以最小化交叉反应的可能性。
3. 信号检测和分辨率
1) 信号强度和背景噪音：确保信号足够强，同时减少背景噪音，以提高检测的灵敏度和准确性。
2)多重标记物的分辨率：在同一个样本中检测多个标记物时，确保各个标记物的信号清晰可分辨。
4. 数据分析
1）图像分析：多重标记物的检测会生成大量复杂的图像数据，如何高效、准确地分析这些图像是一个挑战。
2）数据整合和解释：整合多种标记物的表达数据，进行生物学意义的解释，需要强大的数据分析工具和生物信息学支持。
5. 标准化和可重复性
·1）标准化操作流程：建立标准化的实验操作流程，确保不同实验室之间的可重复性。
2）可重复性验证：通过重复实验验证结果的可靠性，确保mIHC技术在不同样本和不同实验条件下的一致性。
6. 技术设备和成本
1）高端设备需求：需要高端的显微镜和成像设备，这些设备价格昂贵，维护成本高。
2）实验成本：多重抗体和染料的使用增加了实验成本，可能对实验预算有限的研究者构成挑战。
7. 生物样本处理
1）样本质量：确保检测标本质量，如新鲜度和保存条件，以获得可靠的结果。
2）样本制备：优化组织切片和处理方法，以确保标记物的保存和检测效果。
未来发展
名词解释：
多重免疫组化（Multiplex Immunohistochemistry，简称mIHC）：是一种扩展了传统免疫组化（IHC）技术的方法，用于在单一组织切片上检测多种蛋白质标记物。mIHC的原理是通过使用多个不同的抗体，每个抗体绑定一个特定的蛋白质标记物，从而在组织切片上展示出不同的蛋白质表达情况。
多重免疫荧光技术（Multiplex immunofluorescence，简称mIF）：是一种利用荧光标记的特异性抗体和荧光显微镜或荧光扫描仪同时检测多个分子的方法，过去常用于细胞和组织样品中的免疫细胞学和药物研发领域，近年来逐渐在临床病理学显示了巨大的应用潜力。
参考文献：
多色标记免疫组织化学染色和免疫荧光染色在肺癌免疫治疗中的研究进展
The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation
Multiplex Immunofluorescence: A Powerful Tool in Cancer Immunotherapy
Redefining Tumor-AssociatedMacrophage Subpopulations andFunctions in the TumorMicroenvironment
State-of-the-Art of Profiling Immune Contexture in the Era of Multiplexed Staining and Digital Analysis to Study Paraffin Tumor Tissues
Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy
