眼部成像：从历史发展到未来前沿

2.1 自发荧光作为疾病诊断的工具

在眼部，FAF 成像可以检测到不同波长的不同荧光团，该技术已用于视网膜色素变性、老年性黄斑变性、黄斑营养不良、白点综合征和许多其他视网膜疾病的视网膜诊断。FAF 还可用于在细胞死亡之前诊断 RPE 疾病或代谢问题。在许多 FAF 设备中，使用一个或两个光学滤光片来增强图像质量。然而，具有与目标 FAF 相似的激发或发射带的内在荧光团会混淆视网膜成像研究并干扰图像清晰度。这种干扰在白内障和糖尿病视网膜病变的诊断中显而易见。例如，白内障患者眼中的泛黄晶状体会部分吸收 488 nm 的蓝色光，并且与非白内障患者眼中的光散射方式不同，从而干扰自发荧光黄斑色素的检测，从而模糊 FAF 成像的诊断结果。

另一方面，各种视网膜结构的自发荧光不仅可用于诊断眼部疾病，还具有巨大的潜力。2020 年，Wang 等人证明，可以利用 T 细胞的自发荧光特性以非破坏性的方式（使用人体血液样本）区分 T 细胞活动状态。在这项研究中，该团队使用机器学习方法检测 T 细胞代谢辅酶（包括 NAD(P)H）的变化。还可以使用自发荧光寿命成像对不同类型的 T 细胞进行分类。因此，Walsh 等人使用从外周血中分离的 T 细胞，并在培养中使用针对 CD2、CD3 和 CD28 表面配体的四聚体抗体激活它们，显示了静止期和活化期 T 细胞之间的不同自发荧光信号，并强调荧光寿命成像是一种了解 T 细胞活性的非破坏性方法。虽然寿命测量在规避光散射、激发光强度和焦点变化等问题方面优于强度测量，但从分离的 T 细胞寿命测量中得出的结论可能难以在生物系统中重现。值得注意的是，NADH 和 FAD 自发荧光也已用于识别功能状态和区分不同的免疫细胞亚型。在一项疼痛辨别研究中，Gosnell 等人利用免疫细胞高光谱成像结合人工智能和深度学习方法来区分不同疼痛状态下脊髓的炎症，这种方法最终使他们能够区分对照组和受伤组、男性和女性的脊髓。

这些研究表明，利用特定细胞类型的自发荧光特性有可能促进疾病诊断，并提高通过眼睛进行诊断的可能性。值得注意的是，整个中枢神经系统（包括 RPE）中的有丝分裂后细胞都含有脂褐素，这是一种由于氧化应激而产生的色素。脂褐素由 20 多种不同的荧光团组成，其光激发和发射带涵盖紫外线和可见光。在 RPE 中，脂褐素对视网膜健康尤其有害，因为它可以在可见光（尤其是蓝光）光激发下产生活性氧。视网膜脂褐素中最典型的成分是 N-视黄基-N-视黄基亚甲基乙醇胺 (A2E)，其激发和发射带分别在 430–450 nm 和 560–575 nm。而A2E 不可消化，并在 RPE 中的溶酶体（细胞的降解细胞器）中积累。它的积累会干扰胆固醇代谢，造成 DNA 损伤，破坏细胞膜并导致活性氧的产生。因此，A2E 可用作视网膜损伤的自发荧光标记物。此外，脂褐素会在视网膜中积累，并作为视网膜损伤的自发荧光标记物。由于脂褐素在脑损伤、衰老和疾病中积累，因此它也可能是脑损伤的标志物。

2.2 检测淀粉样β蛋白可能有助于诊断阿尔茨海默病

近年来，在 AD 患者视网膜上部周边象限检测到高水平的β淀粉样蛋白，提高了利用此特性进行非侵入性成像诊断该疾病的可能性。在 AD 中，膜结合淀粉样蛋白前体蛋白的蛋白水解过程中，会产生淀粉样肽片段β淀粉样蛋白1-40和β淀粉样蛋白1-42 ，这些片段发生错误折叠，最终导致斑块形成。β淀粉样蛋白斑块在紫外线（360–370 nm）照射下显示明亮的蓝色自发荧光（∼420 nm），在蓝光或绿光激发下，在较长的发射波长下发射强度要弱得多。这些沉积物也会随着年龄的增长在 AD 患者的视网膜中积聚，并导致视网膜神经节细胞层神经退行性变。至关重要的是，在转基因 AD 小鼠中，它们在视网膜中的沉积早于在大脑中的沉积，这表明这是一种合适的早期诊断工具。视网膜淀粉样β蛋白沉积物的体内高光谱成像可将 AD 患者、轻度认知障碍患者与健康对照组区分开来。有趣的是，早期轻度认知障碍患者的高光谱成像特征变化比同龄健康对照组更大，这表明其有望用于早期诊断。在转基因 AD 小鼠中，静脉注射姜黄素（一种与淀粉样β蛋白斑块结合的天然荧光染料）可在 550/525 nm 激发和 605/670 nm 发射下对视网膜斑块进行高分辨率和特异性的体内成像。然而，青光眼和老年性黄斑变性与 AD 一样，具有细胞外淀粉样β蛋白斑块和细胞内 tau 蛋白过度磷酸化逐渐积累的特征。AD 与其他眼部疾病的共同视网膜病理限制了该技术的特异性。因此，用于早期 AD 诊断的视网膜淀粉样β蛋白成像仍是一种发展中的技术。

2.3 小胶质细胞可检测视网膜疾病

利用天然自发荧光检测视网膜疾病的另一个关键潜在途径是小胶质细胞。小胶质细胞在可见光和近红外光谱范围内具有强烈的自发荧光。大脑、脊髓和视网膜中的小胶质细胞通过吞噬和摧毁病原体和碎片来应对免疫挑战和损伤，以及释放细胞因子和其他炎症因子，使中枢神经系统环境不太适合病原体生存，并招募其他免疫细胞到该部位。在此过程中，小胶质细胞会改变其形状、基因表达，并可能改变其自发荧光的光谱特性（激发/发射光谱和寿命）。在稳态条件下，小胶质细胞仍然分枝状，细胞体较小，而在应对免疫挑战、疾病或局部炎症时，小胶质细胞通常具有较大的细胞体，分枝较少。小胶质细胞对炎症刺激的反应变得更为敏感，它们通过吞噬作用和降解来破坏病原体或细胞碎片。由于在此过程中小胶质细胞会在溶酶体中积聚碎片，因此它们的自发荧光特征很可能随着疾病而变化。在芳烃受体 Ahr −/−小鼠视网膜变性模型中的体内成像显示，该模型中小胶质细胞的自发荧光特性发生了变化。进一步推论，脑中心疾病（如溶酶体贮积症）已被证明会反映在动物模型的视网膜变化中，包括视网膜小胶质细胞形态的变化，尽管自发荧光差异尚未得到测试。这些特征表明，视网膜小胶质细胞不仅是视网膜疾病的关键信息来源，也是脑部疾病的关键信息来源。

越来越多的眼组学研究证据表明，在视网膜和大脑的不同疾病条件下，可以使用 FAF 和 OCT 成像技术识别视网膜中小胶质细胞的变化，并且来自眼睛的此类信息可能反映脑部疾病。如上所述，小胶质细胞在 FAF 和 OCT 图像中呈现为高反射灶 (HRF)。这些 HRF 可以在患有多发性硬化症、冯·希佩尔-林道病和糖尿病视网膜病变等各种全身性疾病的个体的视网膜中检测到，并且可以被视为这些疾病状态下小胶质细胞活动的成像生物标志物。尽管关于视网膜 HRF 的起源存在争议，但人们认为它们是由于巨噬细胞迁移、光感受器退化以及蛋白质和脂质沉积导致血视网膜屏障破裂而产生的。视网膜 HRF 与各种视网膜疾病中的小胶质细胞变化高度相关，包括年龄相关性黄斑变性、葡萄膜炎黄斑水肿和糖尿病性黄斑水肿。此外，视网膜小胶质细胞 HRF 可以随时间的推移而可视化，HRF 的动态变化可指示病情进展。HRF 的存在可被视为了解视网膜变性和疾病的临床生物标志物，为眼组学的发展铺平了道路。然而，围绕其作为中枢神经系统疾病指标的潜力存在一些争议。关键限制在于我们缺乏对 HRF 疾病特异性特征的了解。采用机器学习有可能克服这一问题，并允许使用此标记物进行疾病特异性检测。

2.4 拉曼光谱

拉曼光谱是一种有可能用于视网膜成像的新兴疾病检测工具。拉曼光谱使我们能够检测感兴趣分子的振动频率，从而了解键合和化学结构的性质以及特定分子存在下的变化。使用培养的啮齿动物视网膜的体外研究表明，拉曼光谱可以检测到视网膜的炎症变化。使用拉曼光谱的眼组学研究也已用于在小鼠离体视网膜中识别 AD 的早期生物标志物。最近，Alba-Arbalat 等人发明了一种将拉曼光谱和眼科相结合的原型技术，它将分光光度计和扫描激光检眼镜连接起来，并利用它来评估多发性硬化症患者的视网膜分子变化。因此，拉曼光谱可能有助于非侵入性地识别眼部疾病。然而，仍需克服一些重要的挑战。首先，需要进行仔细的体内试验，以验证患者是否不会受到所用激光波长的伤害。其次，还必须确保拉曼光谱能够区分具有相似病理和生化症状的眼科疾病。最后，需要进行高通量图像分析，这一结果可以通过结合传统的人工评估和人工智能辅助数据分析工具来实现。

2.5 人工智能

“人工智能”是一个流行词，由约翰·麦卡锡于 1955 年首次提出，指训练特定领域的非生命实体像人类一样行事。机器学习是人工智能的一个子集，包括深度学习和非神经网络。非神经网络是监督机器学习算法，通常与深度神经网络结合使用，基于多变量分析预测医疗结果，并从多变量数据树中给出单一输出。另一方面，深度学习由多层节点组成，这些节点包含变量(如图像像素、年龄和核苷酸变化等)，这些变量被认为会产生单一输出。在机器学习方法中，机器接受大量数据的训练，使机器能够根据这些数据预测未来结果，包括视网膜图像。

和其他领域一样，近年来，人工智能已广泛应用于眼科和视网膜成像领域。迄今为止，人工智能已用于诊断多种视网膜疾病，包括糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、青光眼、白内障、圆锥角膜和糖尿病性黄斑水肿。在人工智能辅助诊断糖尿病视网膜病变的不同方法中，Gulshan等人开发了两组深度学习算法数据集，敏感度分别为 90.3% 和 87.0%，特异性分别为 98.1% 和 98.5%。已经结合其他算法来验证这种针对不同种族、不同地理区域和不同视网膜病变程度的人群的人工智能模型。这些方法有助于降低筛查成本和准确性，尽管由于图像质量差和图像处理速度慢，人工智能算法在泰国农村地区的现场应用已被证明具有挑战性。这说明了成功实施这类技术所面临的挑战。一项使用英国生物库图像进行的研究发现，16% 的视网膜图像无法通过自动化人工智能方法预测疾病。同样，对大规模放射数据集的分析显示，使用基于人工智能的分类存在惊人的漏诊率。但毫无疑问，未来将看到改进的算法和策略，以应用于真实世界。以人为本的人工智能诊断方法在未来的临床前模型应用中也可能有用。因此，从临床数据集中收集的信息可以反向转化到啮齿动物模型中，以验证假设或测试药物干预效果。Ma 等人以青光眼为例详细阐述了这一概念，并已在狨猴中对精神分裂症相关眼球运动异常的建模进行了测试。