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原文链接：10.1021/jacs.4c15421
使用基于动态共价化学 (DCvC) 的预定位和激活单元，SNAr 反应显著加速。只有在与模型小肽的相邻 Lys 残基形成亚胺时，才会观察到 Cys 对水杨醛衍生物芳香环上 C-F 键的攻击。这种自激活归因于亚胺键相对于稳定反应过渡态的母醛具有更强的吸电子能力，以及阳离子亚胺物种中反应基团的更高预组织。该方法进一步应用于两种抗体的功能化。在这两种情况下，醛基与反应性 C-F 键的紧密接近都导致生物结合产量显著增加，并具有出色的化学选择性。尽管 IgG1 抗体的修饰会导致产品分布随机，但使用 IgG4 时会注意到微环境选择性，这与后者铰链区中 Lys 残基数量较少相符。此外，修饰抗体的后功能化是通过束缚亚胺衍生物与酰肼的动态共价交换实现的，代表了一种前所未有的基于 DCvC 的“标记和修饰”选择性生物共轭策略。相关研究成果发表于《J. Am. Chem. Soc》上。
图文解析
图 1. 图示显示了含有 Cys 和 Lys 残基的蛋白质的拟议微环境选择性生物共轭。A) Cys 与亲电芳环的芳基化。B) Lys 辅助 Cys 芳基化（快速）。醛基与相邻的 Lys 位点形成亚胺物种，激活亲电芳环以实现 Cys 芳基化。C) 与(B) 相同，但增加了一个后官能化步骤，该步骤涉及与酰肼的动态共价交换。
2. A) 本节研究的醛 (A0/A1) 和胺 (AcNαKOMe) 的化学结构。B) AX 的 pD 滴定获得的相对酚盐吸光度 (%) 图，由紫外可见光谱 (D2O, 295 K) 确定。光谱见图 S1 和 S2。A0的 pKaOD 为8.2，A1 的 pKaOD 为7.2。C) 缩合反应 A0:AcNαKOMe (浅橙色) 和 A1:AcNαKOMe (青绿色) 的 Kim 比较。条件：每种组分 5 mM，磷酸盐缓冲液，pD 为 7.8。右侧 Y 轴显示 AX 的 CHO Hammett 分数。
图 3. A) Cys 芳基化反应中所研究组分的化学结构。可电离基团的质子化程度可能因溶液的 pD 而异。B) 反应 34 小时的动力学曲线，由 1 H NMR 光谱法（500 MHz、D2O、pD 7.8、PBS 200 mM、295 或 313 K）确定。括号中的数字对应于物种之间的摩尔比。
4. A) 通过 DFT（B3LYP/6-311g(d,p), PCM = H2O, 298 K）计算得到的 A1-GSH 能量最低构象。上图：正面图。下图：侧视图。S−···C−F 相互作用已用紫色虚线突出显示，以及其距离（4.07 Å）。为清晰起见，所有 H 原子均已省略。B) 通过 DFT 计算得到的（B3LYP/6-311g(d,p), PCM = H2O, 298 K）GSH 硫醇基团与 A1 亲电芳环之间协同 SNAr 反应的能量分布。绿色路径对应于使用游离醛 A1 时获得的能量，而蓝色路径对应于亚胺 A1-GSH 分子内反应。灰色环填充颜色代表芳香族步骤（即试剂和产物），红色代表非芳香族过渡态。有关更多详细信息，请参阅 ESI。
图 5. A) 人类 IgG1 结构表示 (PDB: 1ZHZ)。Lys 残基 (即 K；粉色)、不可接近的二硫键 (即 na C−C；橙色) 和溶剂可接近的二硫键 (即 sa C−C；蓝色) 以空间填充模式表示。B) 铰链区放大视图。Lys (5.5 Å) 和 Cys (2.7 Å) 的高斯表面已被纳入，以突出显示两个侧链的空间接近性。下标 H 和L 分别指重链和轻链。C) IgG1 生物结合中关键步骤的总结，随后通过 HIC 进行分析。颜色代码：蓝线 (二硫键)、深蓝色方块 (硫醇/硫酯物种)、绿色方块 (Cys-芳基化位点)、红色方块 (用 Mc-VcMMAE 修饰的 Cys 位点)。
6. A) 红色 IgG1（约 3 g/L）与 10 当量 A0（浅橙色）、A1（青绿色）或 F1（红色）反应的生物结合产量。B) 红色 IgG1 与 10 当量 A1 生物结合的 DAR 曲线。还包括加权 DAR 值（即 1.1）。反应条件：25 °C，16小时，PBS pH 7.4。在 0 °C 下用 MCVcMMAE 处理 ADC-I1 1.5 小时后，通过 HIC 确定产量和 DAR 值。有关使用 A0 和 F1 时获得的 DAR 曲线和值，请参见图 S17-S18。
图 7. A) 人类 IgG4 抗体 (PDB: 5DK3) 的结构表示。Lys 残基 (即 K；粉色)、不可接近的二硫键 (即 na C−C；橙色) 和溶剂可接近的二硫键 (即 sa C−C；蓝色) 以空间填充模式表示。B) 铰链区的放大视图。已包括 Lys (5.5 Å) 和 Cys (2.7 Å) 的高斯表面，以突出显示两个侧链的空间接近度。下标 H 和L 分别对应重链和轻链。C) IgG4 生物共轭中关键步骤的总结，随后通过 HIC 进行分析。颜色代码：蓝线（二硫键）、深蓝色方块（硫醇/硫酯物种）、绿色方块（Cys-芳基化位点）和红色方块（用 MC-VcMMAE 修饰的 Cys 位点）。
8. A) 用TAMRA 酰肼 (DH1) 对 VcMMAE-ADC-IX 进行后改性以生成 VcMMAE-ADC-IX-DH1（其中 X 为1（对于 IgG1）和 4（对于 IgG4）的卡通表示。该反应通过亚胺-芳腙动态共价交换或通过 DH1 与A1 的游离醛之间的直接缩合发生。反应条件：5 小时，25 °C，PBS pH 7.4，VcMMAE-ADC-IX (5 g/L)，15 当量 DH1。B)初始 VcMMAE-ADC-IX（浅蓝色和棕色光谱）和与 DH1 反应后的后改性 VcMMAE-ADC-IX-DH1（紫色和红色光谱）的 UV-vis 光谱比较，通过 UV Nanodrop（2 μL 样品；PBS 7.4）测量。括号中的数字对应 A555 nm/A280 nm 比率。
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