聚乙二醇修饰药物非临床研究中聚乙二醇相关组织病理学改变及评价关注点

《中国新药杂志》 2024年 第33卷第19期

戎怿，李浩运，李德利，董田甜，孟李凯，宫新江，张慧，闫莉萍

国家药品监督管理局药品审评中心；

江苏鼎泰药物研究（集团）股份有限公司

从20世纪50年代开始，聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）化（一个或多个PEG）就作为一种经典的空间稳定剂广泛应用于医疗领域[1]。通过PEG化修饰，可以使部分受限于药动学等特性的分子开发成为有效药物并获批上市[2]。PEG修饰药物（以下简称PEG药物）常适用于多肽、酶等生物制品，该类产品经PEG修饰后可延长其半衰期、增加稳定性，并在某些情况下改善酶等高免疫原性生物制品的相应免疫原性特征[3]。自1990年第1个PEG蛋白质药物Adagen获美国FDA批准上市以来，至今已有27个同类药物获批上市[4-6]，另有近50个PEG药物目前正处于临床试验不同阶段。

生物技术行业组织委员会于2013年进行了一项行业调查，汇总了10家公司正在开发的17种PEG相关生物制品的信息[2]，在10个产品（10/17）的毒理学研究中可见与PEG相关的组织空泡化。在已获批上市的PEG相关生物制品的非临床研究中，超过一半产品可在大鼠和/或猴中（经皮下或静脉给药）观察到PEG相关的组织学变化，且均以某些组织和细胞类型中的细胞空泡化为特征，这些细胞空泡化组织变化与活性药物预期的病理影响（如组织变性、坏死和细胞畸变）或研究终点（包括血液学、临床化学、尿液分析或器官重量）的变化无关。

由于可在实验动物的多个系统中观察到细胞空泡化现象[7]，但未见明确器质性或功能性损伤[5，8]，Rudmann等[9]提出PEG给药后出现的细胞空泡化属于一种适应性反应，与机体清除PEG的功能增加有关，国内外药品监管机构一直密切关注上述多细胞空泡化现象对人体长期用药安全性的影响[10-11]。本文对PEG药物的组织病理学变化及其评价标准进行总结，并结合相关细胞功能学研究新进展，进一步分析这类药物的非临床安全性评价关注点。

1.1 细胞空泡化的类型

在临床前研究中观察到PEG药物相关的空泡化细胞可分为两大类：吞噬细胞和非吞噬细胞。吞噬细胞类型包括肝脏中的枯否细胞、脾脏中的网状内皮细胞、肺脏内的巨噬细胞、皮下的巨噬细胞、淋巴结内巨噬细胞以及组织内的巨噬细胞（骨髓、胸腺、脂肪组织、卵巢、睾丸、膀胱固有层、阴道、子宫颈、子宫内膜间质等）。非吞噬细胞类型包括肾内的近端肾小管上皮细胞、肾小球足细胞和肾小球内皮细胞、肾上腺皮质细胞、脉络丛上皮细胞、大脑皮层毛细血管和主动脉中的内皮细胞等。此外，在肝脏和某些腺体组织的上皮细胞中也观察到了空泡，如胰岛、前列腺、附睾、乳腺、甲状腺等[12]。

PEG对神经细胞的影响也受到了关注，在给予40kDa PEG药物后，神经元中存在的PEG在恢复期未见清除，但根据神经传导速度以及体外组织样本中退化神经元标记物的结果，PEG药物的存在并未影响神经元的功能或活力[2]。

1.2 空泡化细胞的病理学表现和机制

空泡通常表现为少量到大量细胞质空泡，体积从小空泡（3μm）到大空泡（30μm）不等。空泡成分对过碘酸希夫（periodic acid schiff，PAS）染色、阿尔新蓝染色以及甲苯胺蓝染色均呈阴性[13]，提示空泡中物质并非糖原或黏蛋白成分。随着抗PEG抗体应用检测的敏感度提升，在多项研究观察到空泡存在抗PEG抗体阳性反应[14]，由于该方法较为敏感，甚至可在无空泡的肾小管上皮检测到抗PEG抗体阳性信号[9]。此外，部分细胞空泡为抗PEG抗体阴性[14]。

目前认为吞噬细胞摄取PEG的机制可能是吞噬游离PEG及附近包含PEG的细胞，是否还有其他机制尚不清楚。这种吞噬作用与药物分子表面的物理化学性质明确相关，如分子大小、表面电荷、官能基团和疏水性等特性[7]。对大于250nm的大颗粒一般通过胞饮作用进入细胞，与溶酶体融合后形成胞内的吞噬体，消化降解吞噬物，不能消化的物质可能被保留在溶酶体中形成残留体。随着PEG药物相对分子质量的增加，通过胞饮清除的比例也随之升高。巨噬细胞的吞噬作用属于正常生理功能，因此PEG药物导致的空泡化被认为是一种适应性反应。

1.3 影响空泡化的因素

一般来说，空泡化的发生率和严重程度与PEG的相对分子质量、剂量、给药频率及持续时间等因素相关。

由于PEG主要经肾小球滤过排泄[12]，PEG的相对分子质量越大，排泄效率越低，药物在体内的停留时间越长。小分子PEG药物（如5kDa）易经肾排泄，全身暴露时间短，空泡化程度轻[2-3，14]；当PEG相对分子质量≥30kDa时，细胞空泡化通常更为常见[3-4，14]。

剂量也是关键因素，连续3个月经皮下注射给予食蟹猴PEG药物，不同剂量组（每周8，24，120，160mg·kg^-1）均出现多组织巨噬细胞和上皮细胞空泡化，其严重程度与剂量呈正相关[15]。在160mg·kg^-1组中，脉络丛巨噬细胞、垂体巨噬细胞、脉络膜的巨噬细胞及肾小管上皮细胞均出现空泡化现象。由于空泡化程度过高引起细胞肿胀导致原有组织因挤压产生形变，研究人员将这种伴有组织结构改变的细胞空泡化定义为不良反应，因其对脉络丛上皮功能以及室管膜细胞产生或运输脑脊液具有潜在影响[15]。

1.4 空泡化巨噬细胞的功能评估

关于巨噬细胞空泡化对人体免疫功能的潜在风险，研究者开展了不同的体内外研究。一项体外研究观察了含有20kDa PEG的重组凝血因子VⅢ对人单核细胞衍生巨噬细胞（monocyte⁃derived macrophages，MDMs）形态和功能的影响[16]。以10μg·mL^-1至10mg·mL^-1浓度与MDMs孵育24h，在1mg·mL^-1或更高浓度下观察到明显的空泡化，并在胞内检测到PEG的免疫荧光染色。同时，在PEG暴露环境下，巨噬细胞对荧光细菌的吞噬活性与对照组相比未见明显差异；在静息状态和内毒素刺激后，巨噬细胞表面活性标记物以及分泌炎性因子的水平与对照组相比也未见明显差异。该体外试验结果表明，MDMs仅在PEG浓度远超临床相关剂量的情况下发生空泡化，且空泡化不影响MDMs的活力或功能。该结果提示，PEG介导的空泡化是一种适应性细胞反应。

1.5 细胞空泡化的可逆性评估

在已发表的PEG药物的毒性研究中，涉及细胞空泡化可逆性评估结果包括完全恢复、部分恢复和未恢复。评估空泡化可逆性时应考虑剂量、恢复时间以及组织特异性等差异，研究显示如果给予充足的恢复时间，PEG导致的细胞空泡化现象可逆[2]。在某治疗2型糖尿病的PEG药物（40kDa PEG连接19kDa蛋白）的非临床研究（每2周给药1次，持续4周）中，大鼠和食蟹猴在≥30mg·kg^-1时均出现细胞空泡化现象，包括脾脏、胸腺、肾脏、淋巴结、垂体、肝脏、脉络丛、肠系膜脂肪组织、肾上腺、骨髓、卵巢、子宫、子宫颈、阴道以及注射部位。4周恢复期后，空泡化可见减轻趋势[4]。

有学者提出，恢复时间也可能与组织中PEG清除机制和/或细胞周转差异相关。因此，随着研究中设置的恢复时间延长，细胞空泡化的改善程度通常也随之升高[4]。另外，不同类型巨噬细胞寿命差异较大，MDMs在2周内死亡，而组织中的巨噬细胞可以存活数月（如肝脏枯否细胞寿命约5周至4个月）[17]，因此组织中寿命较长的细胞可能在毒理学研究中更易观察到空泡化，且恢复趋势更缓慢，表明在毒性评估和临床监测时需考虑细胞周转的差异性。

2.1 相关术语

PEG药物的同行评阅文献和公开的监管审查表明，在非临床安全性研究中，最常用于描述PEG相关液泡变化的术语是“空泡化（vacuola⁃tion）”，其他术语包括“泡沫巨噬细胞”和“液泡化”。空泡化的巨噬细胞也通常被描述为“组织细胞空泡化”、“空泡化巨噬细胞”或“泡沫状巨噬细胞”。上述诊断词汇很少对空泡化在形态上属于微泡（microvesicular）还是大泡（macrovesicular）进行区分，监管角度认为“泡沫巨噬细胞”一词提示空泡形态上属于“细小的空泡（finely vacuolated）”[13]，这意味着部分情况下，空泡化在形态上可能与“微泡”一致。对于PEG相关的细胞空泡化程度，除肾小管上皮外尚未见其他组织分级评价标准的文献报道。

2.2 评价标准

表1总结了已发布的严重程度评分标准的指标，其中包含3种肾小管上皮细胞空泡化的评分标准，3种标准均以空泡大小作为依据，胞质内空泡越大严重程度越高。此外，还包含1种用于任何组织或细胞类型的PEG相关组织病理学改变评分标准，与毒理试验常见的五分法较为一致，未给出具体参考指标，主要通过病理学家的经验进行分级。

综合以上文献数据，目前尚缺乏评价PEG空泡化程度的统一标准。建立PEG相关细胞空泡化的严重程度分级标准有助于比较不同研究、不同病理学家和不同类型PEG药物之间的差异。同时，如果临床试验中需要进行安全性监测，也可参考临床前病理严重程度的分级标准。

对PEG相关组织病理学改变（空泡化）进行评价时，通常需重点关注以下几个方面：①空泡化出现的细胞类型和空泡化特点，需清楚地描述器官/组织/细胞类型及诊断术语如泡沫状巨噬细胞、微泡、大泡等。如上文所述，空泡结构的差异可能对应不同的严重程度分级结果。②评估空泡化的发生率、严重程度以及对细胞或组织功能的影响。建立空泡化严重程度分级，评估其对细胞功能是否存在影响，尤其在关键组织如肾脏、脉络丛、肝脏等，空泡化带来的潜在功能损伤主要体现在空泡结构影响细胞正常形态，导致组织结构出现变化，继而影响组织/细胞功能，如脉络丛血管周围间质中巨噬细胞空泡化导致间质扩张，脉络丛形态结构改变，带来脉络丛功能损伤的潜在风险。此外，有时需要考虑通过不同给药方案比较空泡化发生的影响因素。③评估空泡化可逆性时应考虑到剂量、恢复时间以及细胞周转等差异。如上文所述，随着恢复时间的延长，PEG相关的空泡化呈现出可逆性，不同组织细胞/巨噬细胞寿命和周转率也会影响空泡化的可逆性。通常长周期的重复给药毒性试验有助于评估空泡化的可逆性及对重要系统的潜在影响，而深入研究空泡化机制对于评估空泡化的产生原因及风险评估非常重要。

PEG修饰广泛应用于多肽及酶类等生物制品的研发中，在该类药物的非临床安全性评价中常见多细胞类型的组织空泡化。目前对PEG药物引起空泡化的机制与长期安全性影响认识还不充分，本文通过总结PEG药物非临床试验中常见的PEG相关组织病理学变化，分析现有PEG药物安全性评价实践中存在的不足，并提出了PEG药物审评角度的关注点，包括统一术语、建立分级标准、清晰描述空泡化组织病理变化；深入研究空泡化的分子机制及影响因素；关注关键脏器细胞空泡化对功能的影响，对其预期临床风险进行评估，并建立监管措施。本文通过对PEG药物非临床安全性评价研究中PEG相关空泡化组织病理学改变进行综述，以期为此类药物的开发应用以及安全性评估提供参考。