自复制mRNA递送最新研究|LNP中辅助磷脂的优化

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导读：在一项流感RNA疫苗的临床前小鼠模型研究中，80ug HA-mRNA疫苗提供的免疫保护同1.25ug HA-saRNA疫苗相当，但是自复制RNA疫苗注射剂量要比常规mRNA疫苗少60倍。相比常规mRNA疫苗，自复制RNA疫苗展现出极大的优势，通过细胞内 RNA 复制实现持续的抗原表达，显著降低接种剂量和生产成本。目前，虽然自复制新冠RNA疫苗ARCT-154已获批上市，但仍然还需要更多优化工作来增强saRNA疫苗的免疫效果，例如，通过改变LNP脂质成分的化学结构和配方比例来增强saRNA疫苗的递送效率和储存稳定性。

2024年8月11号，Robin团队在Journal of Controlled Release（影响因子10.5）发表文章：《The role of helper lipids in optimising nanoparticle formulations of self-amplifying RNA》，这项研究聚焦辅助脂质对saRNA制剂理化特性、储存稳定性、抗原表达以及免疫原性的影响。将两种不同的可电离脂质（MC3和C12-200）与三种不同的辅助脂质（DSPC、DOPC 或 DOPE）组合制备LNP制剂，探讨辅助脂质对saRNA 的稳定性、转染效率以及炎症和免疫原性的影响。

伦敦帝国理工学院 Robin J. Shattock 教授在自复制 RNA 疫苗的递送系统开发方面发表文献，对此感兴趣的小伙伴可以点击链接查看：https://profiles.imperial.ac.uk/r.shattock/publications

脂质纳米颗粒（LNP） 制剂由可电离脂质、辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质组成。当前，大大多数研究都集中在可电离脂质在 RNA 包封和内体逃逸中的作用。然而，辅助磷脂对于LNP制剂的稳定性和递送效率也非常关键。具有不同的烷基链饱和度、链长和极性头部基团的辅助脂质（如 DSPC、DOPC 和 DOPE）会组装形成不同结构的LNP，例如，DSPC 和 DOPC使得LNP具有圆柱形几何结构，而DOPE 赋予LNP锥形几何结构。

要维持LNP的稳定性和高效递送需要对脂质纳米颗粒膜结构进行微调。据报道，DSPC和DOPC的圆柱形脂质制剂更稳定但是递送效果更弱，而具有融合特性的锥形DOPE制剂以牺牲储存稳定性为代价，转染效率更高。众所周知，脂质化学特性和配方比例会影响 mRNA-LNP 储存稳定性、转染生物分布、抗原表达及免疫原性。但是尚不清楚这些规律是否对比mRNA长度超出3倍、具有更多二级结构的saRNA同样适用。

2.1 不同辅助磷脂组成的 LNP 具有相似的物理化学特性

研究人员使用C12-200或者MC3作为可电离脂质和3种不同的辅助脂质（DOPC、DSPC及DOPE）制备不同的LNP制剂。所有 LNP 的粒径都低于 100 nm，大多数在 70-80 nm，PDI小于0.2。正如预期的那样，由于脂质纳米颗粒表面存在PEG，LNP zeta电位略负，接近中性。所有LNP制剂的包封效率均高于80%。

2.2 DSPC-LNP 表现出良好的理化特性和稳定性

评估6种不同的saRNA-LNP制剂在4℃条件下存储4周的稳定性和转染效率变化。DSPC-LNP 在4℃存放4周，其转染效率没有发生显著变化。DOPC-MC3/C12-200-LNP在存放初始时刻具有最高水平的转染效率，随着存放时间的增加，其转染效率在 4 周内其转染效率分别下降了100 倍和10 倍。与mRNA LNP制剂类似，DOPE-LNP 稳定性最差，其转染效率在4周内显著下降约1000倍。

使用蔗糖作为冷冻保护剂的 Tris 缓冲液作为saRNA-LNP制剂长期存储的缓冲液，分别在4℃、-20℃及-80℃条件存放六个月。结果发现，DSPC-LNP制剂，尤其是 C12-200-DSPC-LNP，在4℃条件下存放表达水平最为稳定。

几乎所有的 LNP 在储存过程中都显示粒径和PDI的增加。PDI 的变化反映了聚集体亚群的形成，而主要群体保持稳定。总体而言，理化特性的变化似乎不会影响saRNA-DSPC-LNP细胞水平的表达效率，只会影响saRNA-DOPC/DOPE-LNP细胞水平的表达效率。这一结果表明，使用 DLS 作为配方稳定性的指标不足以解释saRNA表达水平的变化，需要用其他方法来解决这个问题，例如基于拉曼的化学成分分析。此外，脂质纯度的差异会影响储存稳定性，这是必须考虑本研究的一个局限性。

2.3 DSPC-LNP 体外转染效率低于DOPC/DOPE

采用不同辅助脂质配制的LNP制剂包封Fluc saRNA，转染不同细胞系（HEK 293 T/17、HeLa、hSkMC及THP-1），检测荧光素酶表达。使用 DOPC的MC3-LNP在所有四种细胞系中的saRNA 转染水平明显最高。使用 DOPC 或 DOPE的 C12–200 LNP的saRNA转染水平相似，而使用DSPC的C12–200 LNP导致saRNA转染效率最差。

对于两种可电离脂质来说，含有 DOPC 的制剂通常表现出最高的转染效率。与 DSPC 相比，DOPC 和 DOPE 的转染水平更高，这与之前对 DNA 和 mRNA 制剂使用相同的辅助脂质的研究一致，这表明辅助脂质效应与包封的核酸无关。然而，对于较小的分子（如 siRNA）来说，情况可能有所不同，它们在体外使用 DSPC 制剂的表现更好。

总体而言，LNP 在 HeLa 和 THP-1 细胞中的转染效力较低，其中后者的转染水平最低。与 HEK 细胞相比，这两种细胞都具有更严格的 RNA 翻译调节机制，因为它们具有先天感应能力。与其他细胞系相比，THP-1 细胞也在悬浮液中生长，这会影响细胞摄取和递送的动力学。

2.4 细胞摄取不同辅助磷脂LNP的能力

LNP细胞转染水平与细胞摄取LNP的能力直接相关。用 Cy5 标记 saRNA，以便通过流式细胞术直接检测细胞摄取LNP的能力。总体而言，细胞摄取DOPE-LNP 的能力最强，其次是DOPC-LNP，而DSPC-LNP 最差。此外，THP-1（所有 LNP）和 HeLa 细胞（C12-200 + DSPC 和 MC3 LNP）的LNP摄取能力明显低于HEK 和肌肉细胞，这与saRNA表达水平相一致。

2.5 辅助磷脂影响细胞因子的诱导

细胞摄取LNP后，saRNA 表达水平受细胞天然免疫和抗原呈递细胞分泌的炎性细胞因子的影响。I 型干扰素反应加剧会抑制RNA 表达。在 THP-1 细胞中，MC3 DOPE 诱导的细胞因子明显多于其他制剂，其次是 C12-200 DOPE。在 THP-1 细胞中观察到的 DOPE 制剂诱导更高水平的细胞因子可以通过较高的 LNP 摄取率来解释。在 PBMC 中，C12-200 制剂诱导的细胞因子比 MC3 多，其中 C12-200-DOPE 和 MC3-DSPC 是其各自可电离脂质组中最具炎性的制剂。

用 1 μg saRNA LNP制剂转染从健康供体获得的人皮肤外植体 （1 cm²）。与细胞水平的观察结果相反，DSPC制剂转染效率＞DOPE制剂＞DOPC制剂，这一趋势在C12-200和MC3两种可电离脂质中完全相似。C12-200 的递送效率在各自的辅助脂质制剂中均优于 MC3，并且 MC3 DOPC LNP 几乎没有发生转染。这种现象说明LNP体外转染效率和体内转染效率不具备相关性。

4.1 不同磷脂在小鼠体内的递送效率

在小鼠模型中，肌肉注射5ug Fluc saRNA-LNP，并且分析表达动力学特征。在给药部位周围的肌肉组织中可检测到荧光素酶表达长达 20 天。与皮肤外植体一样，C12-200 LNP 的saRNA表达显著高于 MC3 LNP。C12-200-DOPE-LNP 的初始表达水平高于 DSPC-LNP，但随着时间的推移衰减更快，而与其他 LNP相比，DOPC-LNP 表现不佳。

为了确定不同 LNP 的体内炎症特征与荧光素酶表达之间的关系，收集LNP 给药后 24 小时的小鼠血样，分析细胞因子表达特征。与 PBS 对照组相比，所有制剂诱导的细胞因子表达特征存在显著差异。MC3 LNPs 诱导较高的 IL-6 水平，而 C12-200 LNPs 诱导的 IP-10 水平显著升高。事实上，较高的 IP-10 水平总体上与表达水平的增加相关，而高水平的IL-6 和 MIP-1β 分别与第 10 天和第 20 天的荧光素酶表达呈显著负相关。辅助脂质掺入也影响诱导的细胞因子反应。一般来说，DOPC 对 MC3 和 C12-200 LNP 来说触发的炎症反应较小。然而，每种辅助脂质-可电离脂质组合触发独特的细胞因子特征，表明这种组合及其相关的脂质比率可以定制以提供特定的免疫反应。

4.2 不同磷脂在诱导适应性免疫反应方面的影响

在BALB/c 小鼠模型中，注射1 μg 、 0.1 μg 或 0.01 μg Spike-saRNA LNP疫苗（6种不同的LNP制剂和对照组临床试验LNP），间隔 21 天注射初免疫苗和加强疫苗。在初次疫苗接种后 2 周和 5 周采集血样。

在免疫后第2周和第5周，C12-200 LNPs诱导的结合抗体水平比MC3 LNPs高10倍，比先前临床研究中使用的LNPs高10倍和5倍。与1ug 剂量的DSPC/DOPC- MC3-LNP相比，加强免疫后，MC3-DOPE-LNP触发更强的结合抗体滴度，然而，在0.1ug剂量的情况下，这种优势会丧失。对于C12-200 LNP来说，辅助脂质对结合抗体滴度的影响是最小的。有意思的是，尽管血清结合抗体滴度存在差异，但是，MC3 和 C12-200 制剂诱导的中和抗体水平是相似的，不同辅助脂质的选择也并未造成中和抗体水平的差异。

收集免疫小鼠脾脏， 测定IFN-γ ELISpot 分析 T 细胞反应。总体而言，MC3 和 C12-200 LNP 制剂表现出相似水平的 IFN γ 生成细胞。MC3 与 DSPC 联合使用具有最高水平的 IFN γ 生成细胞，在 C12-200 中也观察到了这一趋势。出乎意料的是，C12-200 与 DOPC 联合使用在给予小鼠的所有三种剂量（1、0.1 和 0.01 μg）中表现出相同水平的 IFN-γ 产生细胞。这一发现需要进一步研究和验证 C12-200 DOPC 诱导不同剂量下诱导 分泌IFN γ脾细胞的能力，因为它可能是开发 T 细胞疫苗的潜在制剂。

为了解细胞因子诱导的差异是否可能反映体液或细胞反应强度的差异，在肌肉注射 1 μg SARS-CoV-2 saRNA-LNP 后 24 小时评估诱导的细胞因子。与 MC3 LNP 相比，C12-200 LNP 诱导的细胞因子水平更高，检测到高水平的 IL-6、IP-10、KC/GRO 和 MCP-1，反映出C12-200 LNP诱导更强的体液免疫。C12-200 DSPC 制剂诱导的细胞因子水平高于 DOPE，而 DOPC 诱导的细胞因子变化水平最高。特别是，MCP-1 的诱导与更强的细胞免疫反应有关，为即使在 0.01 μg 剂量下观察到的细胞反应提供了可能的解释。

在包封saRNA时，使用不同类型的辅助脂质，对于saRNA-LNP制剂的理化特性并无显著差异。LNP制剂在4℃存放4周之内，DSCP-LNP制剂细胞水平的表达效率最为稳定，几乎不会随存放时间延长而发生显著下降。在不同类型的细胞中，与 DSPC 相比，DOPC 和 DOPE 的转染水平更高。与saRNA细胞表达水平相对应的是，细胞摄取DOPE-LNP 的能力最强，其次是DOPC-LNP，而DSPC-LNP 最差。辅助脂质会影响LNP诱导的细胞因子类型和水平。有意思的是，辅助脂质体对saRNA-LNP细胞表达水平的影响与体内表达水平并不存在相关性。

总体而言，含有 DOPC 和 DOPE 的 LNP 在细胞水平表达效果最佳，而 DSPC 制剂被证明是体内递送的最佳选择。此外，离体人类皮肤外植体模型显示出作为LNP转染效率筛选工具的潜力，因为它表现出与体内观察到的相似的 RNA 表达趋势。辅助脂质对LNP制剂存储稳定性的影响会预测其递送的saRNA在皮肤外植体中的表达水平，其中 C12-200 与 DSPC 结合提供了最持久的表达。与MC3-LNP相比，C12-200 LNP可增强荧光素酶表达和Spike saRNA触发的体液免疫反应。对saRNA疫苗触发的体液免疫反应其主导作用的是可电离脂质，而辅助脂质的影响非常微弱。

总的来说，这些结果说明优化saRNA LNP制剂成分和配方的重要性，需要全面考虑其存储稳定性、表达效率以及免疫原性。最佳的saRNA LNP制剂配方应该在上述这些方面实现最佳平衡。