课题组研究成果：表面固定肝素的磁性纳米粒子通过持续释放生长因子和诱导M2巨噬细胞极化促进创伤修复

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常规创面治疗通常效果有限，无法有效刺激创面重建，导致治疗效果差、费用高，并可能出现不良反应。因此，创新且有效的伤口敷料具有巨大的潜力，在调节特定细胞行为、减少炎症、促进血管生成和细胞增殖方面发挥作用，加速伤口功能性再生。对此，瓯江实验室何华成教授课题组、美国阿克伦大学郑洁教授、温州医科大学李校堃院士团队肖健教授通过“贻贝启发”将bFGF表面固定在Fe₃O₄ MNPs上，开发了bFGF和MNPs的组合用于伤口愈合。首先合成了多巴胺-肝素缀合物（HDC），并利用其多巴胺残基与Fe₃O₄磁性纳米颗粒（MNPs）表面的相互作用，成功将其锚定在Fe₃O₄ MNPs表面。由于bFGF和肝素之间的高结合亲和力，HDC涂覆的Fe₃O₄MNPs(HDC@Fe₃O₄)可以有效吸附bFGF形成负载bFGF的Fe₃O₄MNPs(bFGF-HDC@Fe₃O₄)。体外研究表明，bFGF-HDC@Fe₃O₄能保持bFGF在恶劣条件下的生物活性，并实现控制释放。此外，bFGF-HDC@Fe₃O₄还能在体外调节巨噬细胞向M2型表型的极化。进一步采用体内全层创面模型评估了bFGF-HDC@Fe₃O₄在创面愈合中的作用。体内实验结果显示，bFGF-HDC@Fe₃O₄诱导的M2型巨噬细胞极化及其持续释放的bFGF，对创面愈合起到了协同促进作用，显著加速了创面的再生过程。为生长因子输送打开了新的大门，并显示出作为未来生物医学应用的生物材料的巨大潜力。

（A）肝素多巴胺缀合物的制备示意图。通过肝素的羧基和多巴胺的胺基的酰胺化反应，合成肝素-多巴胺缀合物（HDC）。（B）bFGF-HDC@Fe₃O₄的制备示意图。用HDC修饰自制的磁性氧化铁（Fe₃O₄），通过多巴胺儿茶酚中的两个氧原子与Fe₃O₄金属中心之间的双齿螯合作用，形成HDC封端的Fe₃O₄（HDC@Fe₃O₄）。由于肝素特异性结合域对各种生长因子具有高结合亲和力，bFGF可以固定到HDC@Fe₃O₄上，形成bFGF-HDC@Fe₃O₄。（C）Fe₃O₄、CTAB@Fe₃O₄和HDC@Fe₃O₄在水中的稳定性。每个样品在室温下放置0 h或12 h后拍摄图像。初始状态下，裸露的Fe₃O₄聚集在底部，而CTAB@Fe₃O₄在0 h时分散均匀，但在12 h后沉淀出来。相比之下，HDC@Fe₃O₄在水溶液中表现出优异的分散性，12 h内没有明显沉淀，表明HDC成功表面固定到Fe₃O₄上，并且稳定性增强。（D）永磁体分离HDC@Fe₃O₄的侧视图（左）和正视图（右），结果表明HDC改性后仍具有磁响应性。（E）CTAB@Fe₃O₄的三维原子力显微镜图像。（F）HDC@Fe₃O₄的三维原子力显微镜图像，CTAB@Fe₃O₄的聚集，粒径分布不均匀，从16到21 nm，而HDC@Fe₃O₄表现出更均匀的分散性，平均粒径为14 nm，表明HDC@Fe₃O₄的稳定性和分散性得到了改善。（G）CTAB@Fe₃O₄、HDC@Fe₃O₄和bFGF-HDC@Fe₃O₄的Zeta电位。（H）Fe₃O₄（a）、HDC@Fe₃O₄（b）和bFGF-HDC@Fe₃O₄（c）的透射电子显微镜图像。Fe₃O₄（a）显示Fe₃O₄分布不均；HDC@Fe₃O₄（b）中显示，有序均匀的球状Fe₃O₄聚集并嵌入直径为12 nm的纳米球中；bFGF-HDC@Fe₃O₄（c）中显示，bFGFHDC@Fe₃O₄的尺寸约为15 nm，比HDC@Fe₃O₄稍大。bFGFHDC@Fe₃O₄中间有一个空腔，周围是深色的Fe₃O₄纳米颗粒，该结果进一步表明Fe₃O₄纳米颗粒通过HDC和bFGF连接形成的纳米颗粒。

（A）不同浓度（相当于Fe₃O₄）的HDC@Fe₃O₄对不同细胞系（人脐静脉内皮细胞、Raw264.7、NIH3T3和HACAT）的细胞毒性试验。当浓度（Fe₃O₄当量）低于12.5 μg/mL时，它对各种细胞类型都表现出出色的生物相容性。（B）HDC、HDC@Fe₃O₄、bFGF和bFGF-HDC@Fe₃O₄对NIH3T3细胞的细胞毒作用（Fe₃O₄相当于12.5 μg/mL；bFGF相当于2 μg/mL）。与对照组和HDC@Fe₃O₄相比，由于bFGF的生物活性，bFGF和bFGF-HDC@Fe₃O₄均表现出细胞增殖显著增加。（C）活/死染色实验：HDC+Fe₃O₄、bFGFHDC+Fe₃O₄（Fe₃O₄相当于12.5 μg/mL；bFGF-HDC相当于2 μg/mL）处理后的活（绿）细胞和死（红）细胞进行荧光染色。采集强光和荧光图像以评价细胞活力。结果表明HDC@Fe₃O₄和bFGF-HDC@Fe₃O₄MNPs具有良好的生物相容性。

（A）bFGF稳定性研究。将游离bFGF、HDC@Fe₃O₄和bFGF-HDC@Fe₃O₄暴露于各种条件下，并通过CCK-8测定法测量它们对NIH 3T3生长的影响。在没有应激的情况下（无治疗组），游离bFGF本身可以有效促进细胞增殖，表明bFGF具有增殖特性。同样，bFGF-HDC@Fe₃O₄也可以显着增加细胞生长，甚至略高于游离bFGF，表明纳米粒子可以增强或至少不会破坏bFGF的生物活性。（B）bFGF-HDC@Fe₃O₄（bFGF相当于1 μg/mL）的bFGF释放曲线。bFGF-HDC@Fe₃O₄对bFGF具有良好的控制释放能力，在12天内逐渐释放40%的bFGF,有助于bFGF的长期生物活性保留。（C）bFGF生物活性评估。将游离bFGF和bFGF-HDC@Fe₃O₄（bFGF相当于2 μg/mL）在PBS缓冲液中孵育长达12天，并通过CCK-8测定法测量bFGF生物活性。结果表明，HDC@Fe₃O₄在稳定bFGF方面具有积极作用。（D）HACAT细胞系在12和18 h时间点的细胞迁移测定。结果表明，bFGF-HDC@Fe₃O₄ MNPs促进诱导细胞迁移。（E）体外实验装置示意图。将两个0.14T的永磁体直接放在培养板的顶部（N极）和底部（S极），直到实验结束移除磁铁。（F）结果显示，12 h bFGF-HDC@Fe₃O₄组和游离bFGF组之间的细胞间隙没有显著差异，而由于生物活性bFGF的迁移特性增强，两个含bFGF的组的迁移率均高于对照组。

（A）离心沉淀物的照片（黑色箭头所示）。用bFGF-HDC@Fe₃O₄处理的Raw264.7巨噬细胞的裂解物呈现深灰色，而对照细胞呈现纯白色，表明bFGF-HDC@Fe₃O₄可以有效进入巨噬细胞。（B）bFGF-HDC@Fe₃O₄处理后巨噬细胞中铁含量测量，经bFGFHDC@Fe₃O₄处理的巨噬细胞中铁含量显著升高，表明bFGFHDC@Fe₃O₄有效内化到巨噬细胞中。（C）Raw264.7巨噬细胞线粒体的TEM图像。细胞用bFGF-HDC@Fe₃O₄处理2 h。白色箭头所示的黑点为Fe₃O₄纳米粒子。（D）共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像显示细胞摄取bFGF-HDC@Fe₃O₄。用正常培养基（对照）、bFGF和bFGF-HDC@Fe₃O₄处理原始巨噬细胞Raw264.7巨噬细胞3 h，同时使用或不使用eMF（外源磁场）。bFGF用红色荧光染料Cy5预标记。细胞骨架用鬼笔环肽染成绿色。与bFGF处理的细胞中Cy5和鬼笔环肽的微弱共定位相反，在用bFGF-HDC@Fe₃O₄处理的细胞中观察到更明显的Cy5和鬼笔环肽共定位，证实纳米颗粒被内化到细胞中，而不是在巨噬细胞表面。

（A、C）细胞形态的代表性荧光染色图像及巨噬细胞的纵横比统计图。与对照组相比，用bFGF和HDC@Fe₃O₄处理的细胞在24 h内呈现出相似的圆形和薄饼状形状，表明细胞处于M1表型。带有eMF的bFGF-HDC@Fe₃O₄（+bFGF-HDC@Fe₃O₄）显著促进细胞伸长，最高纵横比（AR）约为6，而不含eMF的bFGFHDC@Fe₃O₄表现出较低的AR约为2.5。结果表明，表明带有eMF的bFGF-HDC@Fe₃O₄促进巨噬细胞向M2表型极化。（B、D）巨噬细胞细胞因子的代表性荧光图像及Arg-1/iNOS的表达比例统计图。iNOS是激活M1巨噬细胞的标志性分子，而Arg-1是M2巨噬细胞的标志分子。几乎所有用bFGF处理的巨噬细胞都呈现出与对照组相同的圆形细胞形状，iNOS表达较高，Arg-1表达较低，显示其M1极化。与此形成鲜明对比的是，仅用bFGF-HDC@Fe₃O₄处理的巨噬细胞呈现细长的细胞形状，对Arg-1的染色更阳性。与未加入eMF的bFGF-HDC@Fe₃O₄相比，加入eMF的bFGF-HDC@Fe₃O₄表现出明显更高的Arg-1水平和更低的iNOS表达水平。（E）M1巨噬细胞相关蛋白（iNOS和TNF-α）和M2巨噬细胞相关蛋白（CD206、Arg-1和IL-10）表达的蛋白质印迹分析。用eMF预处理bFGF-HDC@Fe₃O₄显著下调了促炎蛋白（如iNOS和TNF-α（与M1巨噬细胞相关））的表达，同时上调了促愈合蛋白（如甘露糖受体（CD206）、Arg-1和IL-10（与M2巨噬细胞相关））的表达。bFGF-HDC@Fe₃O₄可以促进巨噬细胞极化为M2表型，并且eMF的应用可以增强bFGF-HDC@Fe₃O₄触发M2极化的能力。

（A）体内实验装置示意图。在整个动物过程中（从第0天到第17天）施加0.14T的eMF，两个永磁体相距13.0cm。顶部是磁体的北极，而底部是南极。小鼠在第0天（伤口产生的那天）和第7天接受纳米粒子治疗。对于每个伤口，bFGF的量相当于1.6 μg，Fe₃O₄相当于10 μg。（B-D）各种治疗后不同时间点的伤口床代表性图像及伤口模拟图，不同治疗后伤口愈合率的统计图（第0天初始伤口面积比为100%）。根据伤口图像描绘伤口床的轮廓。在整个伤口愈合过程中，用bFGF-HDC@Fe₃O₄处理的再生皮肤组织疤痕面积明显小于其他组，且与eMF结合的bFGF-HDC@Fe₃O₄比单独的bFGF-HDC@Fe₃O₄表现出更快的伤口修复速度。（E）不同治疗后第7天和第17天收获的伤口组织的H&E染色代表性图像。用bFGF-HDC@Fe₃O₄和eMF处理的伤口在第7天和第17天显示出最丰富的肉芽形成，在伤口部位具有更厚和更多的层。第17天，bFGF-HDC@Fe₃O₄处理组可见明显的皮肤附属器，新生皮肤附属器数量明显增多，与正常皮肤表皮基本相同，表明伤口愈合效率更好。（F）不同治疗后第7天和第17天收获的伤口组织的Masson染色。蓝色代表胶原蛋白的位置。在用bFGFHDC@Fe₃O₄加eMF治疗的伤口中，胶原束的组织纤维更加有序、排列整齐，其次是bFGF-HDC@Fe₃O₄、bFGF和PBS。胶原沉积结果进一步证实，bFGF-HDC@Fe₃O₄加eMF显著增加伤口愈合，并且在所有治疗方法中疗效最好。

（A-C）第7天皮肤组织切片的免疫荧光染色图像、CD 206表达的荧光强度统计图及CD206/CD68荧光表达统计图。CD206：M2表型巨噬细胞（红色）；CD68:泛巨噬细胞标志物（绿色）。bFGF-HDC@Fe₃O₄组抗炎M2标志物CD206阳性表达量最高（4.9±1.9/mm²），其次是bFGF-HDC@Fe₃O₄组（3.6±0.3/mm²）、bFGF组（2.7±0.4/mm²）和对照组（0.8±0.2/mm²）。定量分析进一步证实bFGF-HDC@Fe₃O₄显著增加了损伤部位M2巨噬细胞的极化。（D、F、G）不同组的免疫荧光双染组织切片。CD31：血管（红色）；α-SMA：α-平滑肌肌动蛋白（绿色）。四组创面损伤部位均表达大量聚集在α-SMA阳性细胞周围的CD31阳性细胞。特别是，bFGF-HDC@Fe₃O₄与eMF应用后微血管密度和直径显著增加。结果提示bFGF-HDC@Fe₃O₄可通过刺激新生血管形成，促进创面愈合，为创面提供氧气和营养。（E、H）第7天皮肤组织切片的免疫荧光染色图像。Ki67：增殖细胞（红色）。结果表明Ki67的最高表达水平出现在bFGF-HDC@Fe₃O₄与eMF处理的伤口中。可能是由于通过修饰的MNPs控制bFGF的释放和稳定bFGF，从而促进细胞增殖和组织再生。

新型的均匀稳定的HDC修饰Fe₃O₄磁性纳米颗粒（MNPs），具备诱导M2型巨噬细胞极化和bFGF控释的双重功能。bFGF-HDC@Fe₃O₄表现出良好的生物相容性，能稳定bFGF并通过特定的肝素-bFGF结合实现缓慢释放。在外源磁场（eMF）的作用下，bFGF-HDC@Fe₃O₄显著调控宿主巨噬细胞向抗炎M2型表型的极化。bFGF-HDC@Fe₃O₄促进了伤口的再生，包括肉芽组织形成和胶原沉积，特别是通过促进细胞增殖和M2型巨噬细胞的极化作用。这种新型双重功能的bFGF-HDC@Fe₃O₄为生长因子输送开辟了新的可能性，并展示了作为未来生物医学应用生物材料的巨大潜力。

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