在过去十年中，靶向治疗和免疫治疗在非小细胞肺癌的治疗中取得了显著疗效，不过只有大约四分之一的患者能从靶向治疗中受益。而基于下一代测序（NGS）的肿瘤分子分型是个体化癌症治疗中重要的组成部分。在临床上，NGS目前主要针对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样品进行基因突变的分子图谱刻画，进而指导临床实践中的靶向治疗。然而，常规组织活检可能并不适用于不适合或不耐受侵入性活检的患者以及期望动态监测基因突变的患者。既往研究认为，基于循环肿瘤DNA（ctDNA）的基因突变图谱分析可能存在数据可靠性的问题，可能由于早期患者体内ctDNA水平较低，ctDNA在早期患者中该方法敏感性较低；但也有研究指出ctDNA检测对包括早期疾病在内的非小细胞肺癌具有较高的敏感性和特异性。因此，液体活检与组织来源分子检测的一致性仍然存在争议。
为了比较基于ctDNA和肿瘤组织的靶向基因突变的检测一致性，并明确适合ctDNA检测靶向基因突变的患者特征，四川大学华西医院周清华教授团队和瑞士伯尔尼大学小岛医院的彭仁旺教授团队基于HiSeq 4000 NGS平台的肺癌425基因大Panal测序，深入分析了非小细胞肺癌患者基于ctDNA和肿瘤组织的基因突变图谱。
本研究纳入了85例在术前或全身治疗前接受ctDNA-NGS检测且应用手术大体标本进行NGS的非小细胞肺癌患者，应用定制的425个靶向基因测序，比较ctDNA和肿瘤组织来源的靶向基因突变图谱及其一致性，探讨临床病理特征与突变基因的相关性，评估经典突变基因在ctDNA和肿瘤组织来源中的一致性，并应用机器学习模型识别ctDNA和肿瘤组织来源的NGS突变图谱高度一致的患者特征。
结果显示，在肿瘤组织来源的NGS中，最常见的基因改变主要是错义突变、无义突变和移码突变，其中TP53是最常见的突变基因，发生在49.4%（42/85）的患者中，其次是EGFR（36.5%，31/85）、STK11（14.1%，12/85）、LRP1B（14.1%，12/85）和KRAS（11.8%，10/85）。而与之相对的是，ctDNA来源的NGS突变图谱在基因改变类型上表现出显著的多样性，主要分布在单核苷酸多态性（SNP）中，其中最常见的SNP是NQO1（61.2%，52/85）、GSTM1（54.1%，46/85）、XRCC1（54.1%，46/85）和MTHFR（50.6%，43/85），主要的突变基因为TP53（48.2%，41/85）、EGFR（28.2%，24/85）、LRP1B（10.6%，9/85）和PIK3CA（10.6%，9/85）。在I期肺癌中，应用ctDNA-NGS仅能检测到SNP（图1）。
图1 本研究患者的临床特征及肿瘤组织和ctDNA来源的NGS基因突变图谱
（Bone_meta: Bone metastases; Brain_meta: Brain metastases; CEA: Carcinoembryonic antigen; ctDNA: Circulating tumor DNA; NGS: Next-generation sequencing; Other_meta: Other metastases; Other_mut: Other mutations; SNP: Single-nucleotide polymorphism; TMB: Tumor mutation burden）
在纳入的85例患者中，有44例（51.8%）患者在ctDNA和肿瘤组织来源的NGS突变图谱中表现出一致的基因突变类型。而在所有样本中，在ctDNA和肿瘤组织来源的NGS突变图谱中有236个突变是一致，227个突变仅在肿瘤组织来源的NGS中检测到，607个突变仅在ctDNA来源的NGS中检测到（图2）。
图2 应用热图（A）和瀑布图（B）比较肿瘤组织和ctDNA来源的NGS基因突变图谱（ctDNA: Circulating tumor DNA; FFPE: Formalin-fixed paraffin-embedded; NGS: Next-generation sequencing）
在基于肿瘤组织的NGS基因组图谱中，M分期与EGFR和SMARCA4突变相关，胸腔积液与EGFR突变相关，肿瘤突变负担（TMB）与TP53、STK11、KEAP1和LRP1B突变显著相关。ctDNA和肿瘤组织来源的NGS突变图谱中有11个基因高度一致（相关系数r > 0.5），包括STK11、ALK、ERBB2、ATRX、KEAP1、PTEN、SMARCA4、NF1、LRP1B、PIK3CA和MET。
而针对9个经典突变基因（TP53、EGFR、KRAS、ALK、MET、ERBB2、BRAF、ROS1和RET）而言，应用κ检验评估单一基因在ctDNA和肿瘤组织中的一致性，结果显示疾病分期、骨转移及其他器官转移是评估九基因一致性高低的关键指标，而九基因联合评估在ctDNA和肿瘤组织中一致性较高的亚组预后较差（P = 0.003）（图3）。
图3 Kaplan-Meier曲线比较ctDNA和肿瘤组织中一致性较高和较低的亚组生存
应用6种机器学习算法研究临床特征对κ评分的影响，其中广义线性模型在6种模型中预测准确率最高。基于Stepwise广义线性模型，患者的T分期、M分期、病理分型和TMB与ctDNA和肿瘤组织来源的NGS突变图谱一致性较好相关，而简化回归模型提示T分期和M分期越高的患者，其ctDNA-NGS突变图谱相较于肿瘤组织来源的一致性更高（图4）。
图4 六种机器学习算法（无特征分类器、决策树、广义线性模型、XGBoost、随机森林和SVM模型）研究了临床特征在Kappa评分中的作用，应用列线图显示所构建的预测模型（B）和简化模型（C）预测能力较强（D和E）
本研究为在晚期或转移性非小细胞肺癌中应用ctDNA-NGS进行靶向基因检测提供了理论依据，其中肿瘤分期和TMB是考虑应用ctDNA-NGS的关键指标。此外，ctDNA-NGS与基于组织的NGS在多个特定驱动基因的检测中具有良好的一致性，有助于指导临床靶向治疗。因此，对于不耐受活检活检或需要动态监测的患者，基于ctDNA-NGS可作为一种替代方法。
作|者|介|绍
通信作者：周清华
四川大学华西临床医学院/华西医院胸外科学、肿瘤学教授，博士生导师、博士后合作导师。国际著名胸外科学和肺癌专家、中国十大医学泰斗获得者，享受国务院政府特殊津贴专家。
通信作者：彭仁旺
瑞士伯尔尼大学医学院教授，伯尔尼大学附属小岛医院胸外科实验室主任、博士生导师。中国科学院微生物研究所博士，德国马普生物物理化学研究所博士后，美国达特茅斯医学院访问学者，瑞士苏黎世联邦理工大学独立研究院研究者。
第一作者：黄伟嘉
临床医学博士，四川大学华西医院肺癌中心/肺癌研究所讲师、助理研究员、在站博士后，研究方向为胸部肿瘤的外科综合治疗及表观遗传调控，在Chin Med J、Ann Thorac Surg、Eur J Cardiothorac Surg等国内外高水平期刊以第一作者/共同一作发表SCI论文10余篇，多次在国内外学术会议（WCLC、ELCC、ESMO ASIA等）展示研究成果，以第一发明人公开/授权国家发明专利2项，受邀担任BMC Cancer编委、Eur J Surg Oncol和Front Surg审稿人。
END
供稿｜黄伟嘉
编辑｜潘香香
