Shindo T, Shimokawa H. Therapeutic Angiogenesis with Sound Waves. Ann Vasc Dis. 2020 Jun 25;13(2):116-125. doi: 10.3400/avd.ra.20-00010. PMID: 32595786; PMCID: PMC7315235.
全球老龄化加剧了缺血性心脏病（IHD）的预后问题，迫切需要有效的血管生成疗法。我们研发了低能量体外心脏冲击波疗法，并在动物和人类中验证了其疗效。鉴于超声波的临床优势，我们转向开发针对IHD的超声波疗法。我们的研究表明，特定条件下的低强度脉冲超声（LIPUS）能通过促进血管生成改善心肌缺血。目前，我们正在进行一项前瞻性多中心临床试验以验证LIPUS对严重心绞痛患者的疗效。此外，我们的LIPUS疗法还显示出改善阿尔茨海默病和血管性痴呆小鼠模型认知障碍的潜力。本文总结了声波血管生成疗法的最新研究进展。
1.1 简介
治疗性血管生成研究进展：血管生成研究起源于1800年代，20世纪发现碱性成纤维细胞生长因子。Folkman（1971）提出抑制血管生成可控制癌症，推动了研究。1989年费拉拉发现VEGF，1994年Isner报道VEGF基因疗法治疗下肢缺血成功。1997年VEGF基因治疗缺血性心脏病效果良好。尽管多种方法如干细胞移植被开发，但未成为标准疗法。我们的目标是开发声波微血管生成疗法，结合软件开发创新治疗方法。
2.1 体外心脏SW治疗IHD的进展
超音速波（SW）在爆炸速度超过音速时产生，包含短压力脉冲和低幅度拉伸部分。体外冲击波碎石术已用于治疗尿石症30多年。我们发现低能量SW（尿石症能量的10%）可增强HUVEC中VEGF和NO合酶表达。动物实验和临床试验表明，低能量体外心脏SW疗法对慢性心肌缺血有效且安全，增强血管生成，改善心肌血流，无不良反应。初步临床试验显示症状改善、硝酸甘油使用减少和心肌灌注改善。随机安慰剂对照试验证实其通过血管生成改善严重IHD患者左心室功能，提高生活质量。缩写后的内容保留了原文的主要信息和结论，同时去除了部分细节和重复的数据，使内容更加简洁明了。
体外心脏SW治疗是在SW发生器（Storz Medical AG，Kreuzlingen，瑞士）中内置回波诊断装置，在回波引导下指定照射部位，与心电图R波同步照射SW。低能量 SW 共照射 9 个点 1800 次（0.09 mJ/mm2，200次/点)到左心室(LV)缺血部位的LCx区域。
图 1 体外心声波 (SW) 疗法在难治性心绞痛患者中的应用。
该机器配备了 SW 发生器头和在线超声心动图。使用时，SW 发生器附着在患者的胸壁上。SW脉冲在超声心动图引导下很容易聚焦于缺血心肌。不需要麻醉或镇痛药。
图2 体外心声波（SW）治疗对难治性心绞痛患者心肌灌注的影响。
患有严重三支冠状动脉疾病的患者在 SW 治疗前后的双嘧达莫应激铊 201 单光子发射计算机断层扫描 (SPECT) 成像和极坐标图。结果清楚地表明，仅在应用SW疗法的心肌缺血部位心肌灌注得到改善；第一次治疗（第一次 Tx）后的前间壁和第二次 Tx（箭头）后的侧壁在分阶段 SW 治疗后逐步进行。（来自参考文献6）
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在猪模型中，SW疗法显著改善了心肌梗塞后左室重构，表现为左心室射血分数和舒张末期容积的改善。这是首个证明SW疗法有效性和非侵入性的实验。在另一急性心肌梗死模型中，SW治疗也显著提升了左心室射血分数。基于这些结果，我们进行了首个临床试验，纳入17名AMI患者，未发现手术相关并发症或副作用，且磁共振成像显示6个月和12个月后无有害重塑迹象。
2.2 SW 疗法的其他适应症
继积极结果后，我们开展了多项临床试验以扩大SW疗法的适应症。研究发现，SW疗法对PAD患者有效，尤其是严重肢体缺血者。在兔模型中，低能量SW照射显著提升了血流量和毛细血管密度。随后的临床试验证实了SW疗法对间歇性跛行PAD患者的症状、步行距离和外周灌注的改善效果。此外，SW疗法还对雷诺现象和系统性硬化症患者的手指皮肤溃疡有效，增强了伤口愈合。在淋巴水肿模型中，SW疗法通过上调VEGF-C和bFGF改善淋巴系统功能。最后，在骨科疾病和脊髓损伤模型中，中等能量SW显示出抗炎和促进运动功能恢复的效果。总结：低能量SW疗法是一种有前景的非侵入性治疗手段，对PAD、雷诺现象、皮肤溃疡、淋巴水肿和骨科疾病均有潜在疗效。
3.1 低强度脉冲超声（LIPUS）治疗IHD的进展
我们的研究显示，低能量心脏冲击波（SW）疗法能够促进新血管生成，改善心肌功能障碍。由于SW和超声波均能穿透人体组织，我们进一步探索了低强度脉冲式超声波（LIPUS）作为非侵入性血管生成疗法治疗缺血性心脏病（IHD）的潜力。LIPUS在多种模型中显示出血管生成潜力，我们通过针状水听器测试了不同声压和周期数的LIPUS条件，并发现在32个周期时VEGF mRNA表达上调最显著。我们的研究表明，LIPUS能有效诱导治疗性血管生成，改善心肌缺血，并在猪模型中提高左心室射血分数（LVEF）。此外，在急性心肌梗死（AMI）小鼠模型中，LIPUS增强了血管生成并改善了左心室重塑。基于这些结果，我们在日本启动了一项双盲、安慰剂对照试验以验证LIPUS在人类中的有效性和安全性。
图3 低强度脉冲超声（LIPUS）对体外人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的影响。
不同循环次数下的声压。LIPUS 治疗在体外上调 HUVEC 中血管内皮生长因子 (VEGF) 的 mRNA 表达，并在 32 个周期时达到最大效果。结果表示为平均值±平均值的标准误差 (SEM)（每个 n=9-11）。（来自参考文献43）
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图 4 低强度脉冲超声 (LIPUS) 疗法可改善猪体内缺血引起的心肌功能障碍。
植入 ameroid 收缩器 (pre-Tx) 后 4 周，对照组和 LIPUS 组中左回旋冠状动脉 (LCx) 区域的左心室 (LV) 壁运动减少至相同程度。LIPUS 治疗后 4 周（Tx 后），左心室造影显示仅 LIPUS 组的左心室壁运动显着改善。（来自参考文献43）
3.2 LIPUS 治疗有益效果的可能机制
血管内皮细胞直接接触血流，受剪切应力等机械刺激影响，引发细胞结构和功能变化。小凹是质膜内陷，直径40-80nm，负责将机械刺激转化为化学信号（机械转导）。Caveolins与多种信号蛋白结合，小穴膜富含胆固醇、鞘糖脂和信号酶。整联蛋白调节多种信号途径。Caveolin-1通过与β1-整合素相互作用感知机械应力。LIPUS（低强度脉冲超声）在HUVEC中诱导mRNA上调程度高于心肌细胞，表明其在血管生成中的关键作用。LIPUS影响VEGF和粘着斑通路，后者包含Caveolin-1和β1-整合素等关键力转导蛋白。siRNA实验显示caveolin-1、β1-整合素、Fyn、FAK、ERK1/2和Akt参与LIPUS诱导的VEGF上调。LIPUS诱导的VEGF上调被小干扰RNA敲低或甲基-β-环糊精抑制。Cav-1敲除小鼠中LIPUS对MI后LV重塑的有益作用减弱，表明内皮细胞在LIPUS治疗中的关键作用。总之，LIPUS通过声流诱导小凹变形，传递机械刺激至细胞内信号通路，增强VEGF表达，促进血管生成。
图 5 血管生成诱导声波 (SW) 的拟议分子机制。
我们的基因靶向研究结果表明，声波（低强度脉冲超声 (LIPUS) 和低能 SW）产生的声流会导致 β 1 -整合素和小窝蛋白-1 引起的小凹变形，从而传递机械刺激Fyn 和 FAK 的磷酸化会诱导 Erk1/2 和 Akt 磷酸化，从而增强内皮一氧化氮合酶 (eNOS) 和血管内皮生长因子 (VEGF) 的表达以及随后的血管生成。（来自参考文献45和61）
关键分子如Fyn、FAK、β1-整合素和Caveolin-1在血管内皮细胞的增殖和血管生成中起重要作用，受机械刺激如剪切应力影响。LIPUS对细胞周期、代谢、RNA运输等有影响，可能通过改变钙离子水平发挥作用。超声波诱导的声孔作用与钙离子流入相关，影响LIPUS的生物效应。剪切应力通过β1-整合素激活和Caveolin-1磷酸化介导信号传导，影响ERK1/2和PI3K-Akt途径。研究发现，AMI后caveolin-1表达增强，增加对LIPUS的敏感性。LIPUS还能改善左心室压力超负荷心脏的收缩功能障碍，通过增强心肌血管生成和减轻纤维化实现。
3.3 LIPUS 疗法的其他重要适应症
我们的研究旨在探索LIPUS疗法对痴呆症的疗效，特别是血管性痴呆（VaD）和阿尔茨海默病（AD）。全球痴呆症患者数量预计将从2015年的4700万增至2050年的1.31亿。目前尚无治愈方法，而低强度脉冲超声（LIPUS）已被证明能促进神经营养因子产生和神经再生。我们基于心肌缺血模型的积极结果和最新研究，对两种痴呆症小鼠模型进行了实验。LIPUS显著改善了认知障碍，并在VaD模型中增加了CD31阳性内皮细胞和Olig2阳性少突胶质细胞前体细胞，在AD模型中减少了Iba-1阳性小胶质细胞和淀粉样蛋白-β斑块。RNA测序显示eNOS等内皮相关基因上调，且神经胶质细胞与神经营养蛋白和eNOS表达增加之间存在显著相关性。这些效果在eNOS-KO小鼠中消失，表明eNOS是关键分子机制。基于这些结果，我们启动了一项针对AD患者的全脑LIPUS治疗试验，预计2021年完成。
图 6 低强度脉冲超声 (LIPUS) 疗法可减少小鼠阿尔茨海默病模型中的 Aβ 斑块。
LIPUS 治疗后第 86 天的冠状切片 Aβ 免疫染色（棕色）的代表性图像；下面的 3 个图显示了大脑皮层、海马体和丘脑的放大视图。与对照组相比，LIPUS 治疗显着减少了整个大脑的 Aβ 沉积。比例尺代表 500 µm（全脑）或 50 µm（下面 3 个面板）。（来自参考文献70）
图7 示意图显示了全脑低强度脉冲超声（LIPUS）疗法对两种小鼠痴呆模型的有益作用的潜在机制。
我们的研究结果表明，内皮一氧化氮合酶 (eNOS) 的激活对于 LIPUS 治疗在两种模型中的有益效果起着关键作用。eNOS 会增加血管性痴呆 (VaD) 模型中少突胶质细胞前体细胞 (OPC) 的增殖，并减少阿尔茨海默病 (AD) 模型中的小胶质细胞。OPC 的增殖导致成熟少突胶质细胞的增加，最终导致髓鞘再生。eNOS 还抑制 Aβ 的产生和积累。eNOS 诱导的血管生成通过改变脑血流在神经发生中发挥重要作用。最后，在 VaD 模型中，认知功能障碍可以通过髓鞘再生、血管生成和神经发生来改善，在 AD 模型中，可以通过减少小胶质细胞增生和 Aβ 斑块以及增加血管生成来改善。
4.1 结论
应用SW或LIPUS的新型物理疗法显示了血管生成治疗的新可能性，并且一系列证据已经出现。有趣的是，我们能够证明常见的细胞内机制和途径似乎与 SW 和 LIPUS 的血管生成作用有关，包括内皮细胞小窝中的 β 1 -整合素/caveolin-1、ERK1/2 和 Akt 磷酸化、VEGF/eNOS表达，并最终促进内皮增殖。然而，两个SW的物理特性不同；SW 疗法会产生很强的剪切应力，而 LIPUS 则具有较低的剪切应力并具有一些热效应。因此，根据靶器官正确使用这两种软件非常重要。例如，SW疗法可能更适合应用于硬组织，例如骨骼和软骨，而LIPUS可能更适合应用于软组织，例如大脑和内脏器官。此外，虽然SW疗法有潜在的肺出血风险，但LIPUS没有明显的不良反应，与其靶器官无关。SW 疗法和 LIPUS 的有益效果通常可能是通过增强的各种内在途径介导的，其中机械转导及其下游途径似乎参与其中。尽管精确的细胞内机制仍有待完全阐明，但低能量体外 SW 和 LIPUS 疗法有望作为有效、安全和非侵入性的方法，不仅治疗缺血性心血管疾病，而且治疗广泛的缺血/炎症性疾病。
