Shindo T, Eguchi K, Monma Y, Kanai H, Yasuda S, Shimokawa H. Optimal treatment conditions for low-intensity pulsed ultrasound therapy for Alzheimer's disease: applications from mice to humans. J Med Ultrason (2001). 2024 Jul;51(3):419-427. doi: 10.1007/s10396-024-01461-9. Epub 2024 May 2. PMID: 38698287; PMCID: PMC11272751.
目的： 我们之前开发了一种低强度脉冲超声（LIPUS）新疗法，通过上调阿尔茨海默病（AD）小鼠模型中的内皮一氧化氮合酶（eNOS）来改善认知能力下降。在一项随机、双盲、安慰剂对照试验中，我们证明全脑 LIPUS 疗法是安全的，并且往往可以抑制早期 AD 患者的认知能力下降。我们在此报告我们为试点试验进行的基本实验的结果，以便将全脑 LIPUS 疗法也应用于人类。
方法： 首先，我们使用人类颞骨检查骨密度/厚度与超声透射率之间的关系。接下来，根据超声透射率的结果，我们进一步检测了 VEGF、FGF2 和 eNOS 的 mRNA 表达对不同超声频率、占空比和声压的响应。
结果： 骨厚度与透过率之间存在显着相关性（1.0 MHz，P < 0.001），而骨密度与透过率之间不存在显着相关性（1.0 MHz，P = 0.421）。在 0.5 MHz 频率下，最佳占空比被认为高达 20%。当组织振幅在0.05-0.5 MPa范围内时，LIPUS显着上调VEGF、FGF2和eNOS。因此，对人脑进行 LIPUS 治疗所需的条件被确定为声压略低于探头 1.3 MPa（组织振幅 0.15 MPa）、占空比 5%、频率 0.5 MHz。
结论： 我们成功确定了 AD 患者 LIPUS 治疗的最佳治疗条件。
一、LIPUS 颅内治疗的最佳声场设置
据报道，随着 AD 的进展，Aβ 在海马体以外的整个大脑中积聚 [ 15]。因此，我们旨在将LIPUS应用于从人类头骨中厚度最薄的双侧颞骨开始的整个大脑，并设计了一种能够获得足够声场的特殊探头。对于 LIPUS 治疗，我们使用带有双极放大器（BA4825；NF Corporation Yokohama，日本）的多功能发生器（WF1974；NF Corporation Yokohama，日本）和平面超声探头（Honda Electronics Co，爱知县，日本）。作为对人类头骨体积的估计，探头的曲率半径是根据日本头骨尺寸数据库（日本东京工业科学技术厅）设置的。此外，在东北大学医院接受头部MRI检查的成年患者中，颞骨到海马的距离被确定为75-85毫米。因此，我们设计了探头，使从表面经过颞骨后 8 mm 深度的声压处于治疗范围内（振幅 0.1-0.5 MPa）（图 1）。1）。使用市售的声强度测量系统（Eastek Corporation，东京，日本）和 PVDF 针式水听器（Eastek Corporation，东京，日本）作为声场测量装置。LIPUS 换能器到水听器的距离为 80 mm。另外，出于安全考虑，我们将声压设置为不超过𝐼spta（空间峰值时间平均强度）基于日本工业标准的颅骨中240mW/cm 2 。
LIPUS 治疗的声压分布 显示了使用声强度测量系统对超声探头进行声场分析。探头正下方的能量最高。我们设计超声波探头时，经过颞骨后8毫米深度的声压在治疗范围内（振幅0.5-1.0 MPa）
们在初步研究中发现，1.875 MHz 的频率几乎没有穿过人类头骨厚度的传输（数据未显示）。因此，为了增强 LIPUS 通过人类头骨的透射率，我们研究了更长的波长，即 0.5 和 1.0 MHz。
本研究中使用的超声探头的中心频率为 0.5、1.0、1.5 和 1.875 MHz，具体取决于实验系统。基于 72 mW 的超声波输出，我们仅使用符合 ± 8% 变化标准的探头。使用高性能电子天平型低超声功率测量装置（UPM-DT-1E；Eastek Corporation，东京，日本）测量超声输出。探头形状是圆形平面元件（直径26毫米、28毫米）。
它们在以下照射条件下暴露于 LIPUS（频率：0.5、1.0 和 1.875 MHz；占空比：1、5、10、20 和 40%；振幅：0.05、0.1、0.15、0.25、0.5、1.08、和 2.2 MPa）持续 20 分钟（每个 n = 12）。由于在占空比为40%以上时，元件表面的发热不能被忽视，因此我们只研究了占空比1、20和40%条件下的情况。关于声压，参考我们之前的报道，超过2.2 MPa的声压被认为具有高度细胞毒性[ 2 , 3 ]。脉冲重复率 ( PRT ) 固定为 320 μs，以符合之前的报告 [ 2 , 3 ] 和安全标准 [ 16 ]]。
在使用人类头骨的验证中，我们发现在头骨厚度2-5mm范围内的任何厚度下，0.5MHz的透射率均高于1.0MHz的透射率（图 2）。基于这些结果，我们将通过肋间隙的心脏频率 1.875 MHz [ 2 , 3 ] 修改为通过人类头骨的大脑频率 0.5 MHz。
我们将照射条件固定在频率为0.5 MHz、占空比为20%，声压（振幅）范围改为0.05~2.2 MPa，这是可以用凸面设置的声压传感器。最佳组织振幅为 0.05–0.5 MPa。为了在人脑中达到这个声压，估计探头下方的声压需要在 0.5-1.5 MPa 范围内。我们最终将处理条件设定在安全标准以下（Ispta不超过240 mW/cm 2），且高于功效标准（探头正下方声压应大于0.5MPa）。
讨论
在本研究中，我们的目的是在之前对 AD 小鼠模型进行实验后，确定人类 LIPUS 治疗的最佳治疗条件。我们能够确定人脑的治疗条件，包括探头下方的声压为 1.3 MPa（组织振幅为 0.15 MPa）、每个占空比为 5%、频率为 0.5 MHz。
在我们之前使用心脏病动物模型的基础实验中，我们在以下条件下进行了LIPUS治疗：中心频率1.875 MHz，脉冲重复频率2.74 kHz，周期数32（17𝜇s突发长度，即占空比 = 4.7%），𝐼spta（空间峰值时间平均强度）117–162 mW/cm 2，声压0.25 MPa [ 2 – 8 , 10 ]。我们证明，这种治疗条件物理刺激血管内皮细胞膜上的小窝，并诱导一系列细胞内信号，通过 eNOS 促进细胞增殖和组织修复[ 17]]。在以往的小鼠动物实验中，小鼠头骨的厚度不足1毫米，因此超声波传输的衰减可以忽略不计。然而，当相同的条件应用于人类头骨时，很难忽略衰减。在本研究中，人类颅骨中最薄的颞骨约为3-5毫米，在0.5 MHz时，可以将超声波以30-40%的衰减率传递到颅骨。此外，随着AD的进展，Aβ的积累会扩散到整个大脑，因此我们设计了一种扩散型治疗束，可确保符合日本工业标准的安全性。我们确认了这个超声波声场（图 1 ）。在临床试验中，我们将其设计为在海马最深处（约8厘米深）产生0.15至0.19 MPa的声压，而头骨正下方的声压则需要在1.0至1.5 MPa以下才能产生。确保安全[ 11 ]。扩散探头的锥角是根据日本老年人的平均头骨大小设定的。
下一个问题是骨骼特性（例如厚度和密度）对声压透射率的影响。特别是在老年患者中，我们认为骨密度不容忽视，但本研究中未发现骨密度与透射率之间存在显着相关性。有趣的是，骨厚度和透射率的散点图线性函数巧合地显示出负相关性，在 0.5 MHz 和 1.0 MHz 处具有完全相同的斜率 (-0.098)。最初为心脏病开发的 LIPUS 疗法根据心脏超声诊断设备的标准将频率设置为 1.875 MHz。然而，我们需要将频率修改为低于1.0MHz，以便LIPUS能够充分穿透人类头骨。使用血管内皮细胞的研究表明，即使在 0.5 MHz 的频率下，LIPUS 诱导的 VEGF mRNA 表达也可以重现。然而，我们无法确定为什么在 1.0 MHz 频率和 20% 占空比或 0.5 MHz 频率和 1% 占空比下没有观察到 VEGF 上调。然后我们发现，当频率固定在 0.5 MHz 时，最佳占空比高达 20%。此外，通过评估 VEGF、FGF2 和 eNOS 的 mRNA 表达，我们发现最佳声压为 0.05 至 0.5 MPa。基于这些结果，最佳治疗条件最终从安全标准上限缩小到两个条件，并重新测试VEGF的表达效果。我们无法确定为什么在 1.0 MHz 频率和 20% 占空比或 0.5 MHz 频率和 1% 占空比下没有观察到 VEGF 上调。然后我们发现，当频率固定在 0.5 MHz 时，最佳占空比高达 20%。此外，通过评估 VEGF、FGF2 和 eNOS 的 mRNA 表达，我们发现最佳声压为 0.05 至 0.5 MPa。基于这些结果，最佳治疗条件最终从安全标准上限缩小到两个条件，并重新测试VEGF的表达效果。我们无法确定为什么在 1.0 MHz 频率和 20% 占空比或 0.5 MHz 频率和 1% 占空比下没有观察到 VEGF 上调。然后我们发现，当频率固定在 0.5 MHz 时，最佳占空比高达 20%。此外，通过评估 VEGF、FGF2 和 eNOS 的 mRNA 表达，我们发现最佳声压为 0.05 至 0.5 MPa。基于这些结果，最佳治疗条件最终从安全标准上限缩小到两个条件，并重新测试VEGF的表达效果。我们发现最佳声压为0.05至0.5 MPa。基于这些结果，最佳治疗条件最终从安全标准上限缩小到两个条件，并重新测试VEGF的表达效果。我们发现最佳声压为0.05至0.5 MPa。基于这些结果，最佳治疗条件最终从安全标准上限缩小到两个条件，并重新测试VEGF的表达效果。
目前的结果已应用于试点试验，以探讨 LIPUS 治疗早期 AD 患者的有效性和安全性，并取得了有希望的结果 [ 11 ]。在这项试点试验中，资格标准包括临床痴呆评分 (CDR) 总体评分为 0.5-1.0 且日本简易精神状态检查 (MMSE-J) 评分超过 20 的患者 [ 11 ]。LIPUS 治疗或安慰剂手术在门诊患者中进行，为期 18 个月，间隔 3 个月，总共 6 个疗程（18 次治疗）。在安慰剂组中，ADAS-J cog（主要终点）的变化在 24、48 和 72 周时随着时间的推移而恶化，而在 LIPUS 治疗组中没有发现任何变化 [ 11 ]。
应该提到本研究的几个局限性。首先，关于声场测量，假设传播衰减的影响比生物组织更小，因为我们在本研究中使用了水。由于很难准确预测实际脑组织中的传播衰减，因此我们使用水作为血流丰富的脑组织的替代品。我们还验证了风险在可接受的范围内，例如声压不会变得太高。其次，有报道称松质骨和皮质骨体积比与超声的传播有关[ 18]]。在本研究中，我们没有测量松质骨和皮质骨体积比，这可能会影响超声透射率。这一点还有待在未来的研究中进行检验。第三，在本研究中，虽然我们使用了人类头骨，但不规则反射很难完全模拟。因此，很难可靠地验证颅内超声漫反射的安全性。第四，我们使用培养的血管内皮细胞来确定治疗超声条件，但可能有必要使用大型动物来检查其在体内的功效。第五，虽然本研究是以日本工业标准的安全标准内的输出为前提进行的，但可能有必要验证比当前标准更有效的输出条件。
结论
我们对人颅内LIPUS治疗的“全脑照射”概念进行了基础实验，并成功确定了人体的最佳治疗条件。我们也计划在下一个关键临床试验中采用相同的 LIPUS 治疗条件。
