低强度脉冲超声在慢性心肌缺血猪模型中诱导血管生成并改善左心室功能障碍

LIPUS 声压测量

我们测量了不同条件下 LIPUS 的声压[频率，1.875 MHz；脉冲重复频率，7.10 kHz；周期数：1、16、32、48 和 64；施加到每个换能器元件的电压，11.30∼88.18伏（V）；Ispta，151∼193 mW/cm ² ]通过使用针状水听器。脉冲超声的周期数是指每1个脉冲的声波数量，而诊断超声设备则使用1个周期。然而，在本研究中，我们测试了从 16 到 64 的更多周期（图 1）。控制施加到每个换能器元件的电压，以保持 LIPUS 的估计空间峰值时间平均强度 (Ispta) 低于声输出标准的上限 (<720 mW/cm ² ）用于诊断超声设备（美国食品和药物管理局的 Track 3 限制）并防止超声探头温度升高。

LIPUS对人脐静脉内皮细胞的体外影响

我们购买了单供体人脐静脉内皮细胞（HUVEC）（Lonza，巴塞尔，瑞士）并将其培养在完全内皮培养基（EGM-2 BulletKit，Lonza）中。HUVEC 进行传代培养并在第 3 至 5 代使用，并维持在 EGM-2 中。对于 LIPUS 治疗，我们使用了诊断超声设备（Prosound α10；HITACHI Aloka Medical, Ltd., Mitaka, Japan），其照射条件可以通过软件修改来修改。在LIPUS处理前24小时，将HUVEC(1×10 ⁵ )用EGM(Lonza)重悬于2ml管中。将细胞暴露于各种条件的 LIPUS [频率，1.875 MHz；脉冲重复频率，7.10 kHz；循环次数，1、16、32、48 和 64 个循环；施加到每个换能器元件的电压，11.30∼88.18伏（V）；Ispta 151∼193 mW/cm² ] 20 分钟（每个 n = 9-11）。照射后，将细胞在相同的培养基中保存3小时，然后提取RNA，并在提取蛋白质之前保存20分钟。

体外实时聚合酶链反应和蛋白质印迹分析

使用 RNeasy Micro Kit（Qiagen，希尔登，德国）提取总 RNA。使用QuantiTect逆转录试剂盒(Qiagen)对总RNA(600ng)进行逆转录。使用实时检测系统（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA）进行实时聚合酶链反应（RT-PCR）。引物序列为（正向、反向）5'-GAGCCTTTGCCTTGCTGCTCTA-3'、5'-CACCAGGGTCTCGATTGGATG-3'（血管内皮生长因子（VEGF））、5'-GTGTGCTAACCGTTACCTGGCTATG-3'、5'-CCAGTTCGTTTCAGTGCCACA-3'（血管内皮生长因子）碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），5'- TTCTGACTGCACAAACCAGCTTC-3'、5'-TTTGACACCACACACAGCTTCAC-3'（适用于 Flk-1）和5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3', 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′为 β-肌动蛋白，所有这些均由 Perfect Real Time Support System（Takara Bio Inc.，Otsu，日本）设计。使用β-肌动蛋白作为内部对照，并使用SYBR Premix Ex Taq I和II（Takara Bio Inc.）来检测VEGF cDNA。

使用特异性识别蛋白质的抗体进行蛋白质印迹分析，包括 eNOS（总 eNOS；Cell Signaling Technology，MA，美国）和 Ser1177 处的磷酸化 eNOS（p-eNOS；Cell Signaling Technology）。含有 p-eNOS 和 eNOS 蛋白的区域通过电化学发光蛋白质印迹管腔试剂 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) 可视化。p-eNOS 的程度通过 eNOS 的程度标准化。

猪慢性心肌缺血模型

在本研究中，我们总共使用了 60 头家猪（体重 25 至 30 公斤）。使用美托咪定（0.05 mg/kg，IM）和咪达唑仑（0.3 mg/kg，IM）镇静后，我们通过吸入 2-5% 七氟烷维持麻醉，用于植入 ameroid 缩窄器、LIPUS 治疗和静脉注射安乐死植入 ameroid 缩窄器后 8 周注射 5% 氯化钾（图 2）。我们打开胸腔，悬吊心包和左心耳，显露左冠状动脉回旋支 (LCx)，并在近端 LCx 周围放置 ameroid 收缩器（Research Instruments NW，黎巴嫩，俄勒冈州），以逐渐诱导动脉完全闭塞。4周内不会引起心肌梗塞[4] 。该模型广泛用于检查血管生成疗法对缺血性冬眠心肌的影响[4]、[13]、[14]。在本研究中，在随机分组前排除了怀疑患有心肌梗死（例如严重节段性左心室壁变薄）或根据第4周超声心动图研究显示左心室射血分数（LVEF）超过55%的动物。最后，28 头猪被分配到 2 组（LIPUS 组）或没有（对照组）LIPUS 治疗，使用块随机化，块大小为 6。我们定义了 8 周时对照组和 LIPUS 组之间 LVEF 的绝对变化作为主要终点，具有不配对的t测试且 α = 5%。假设 LIPUS 疗法与我们之前的 SW 疗法具有相似的效果，则 8 周时 LVEF 绝对改善 10% 是我们样本量计算的假设效果大小。功耗分析是在 R 版本 3.0.3 中进行的。根据我们的假设，总共 8 头猪确保了 90% 的统计功效。因此，本研究（每项 n = 9）具有足够的统计功效。

LIPUS治疗慢性缺血性心肌

在体外实验的基础上，LIPUS（32个周期照射20分钟）通过3个不同短轴水平的二维扫描应用于侧壁（缺血区域），包括（1）基底左心室， (2) 乳头肌水平，(3) 心尖附近（图 2）。在使用的 28 头猪中，我们在植入 ameroid 缩窄器后 4 周对 14 头猪进行了 LIPUS 治疗（LIPUS 组，每周 3 次），而我们对其余 14 头猪进行了相同的麻醉程序 70 分钟，但未接受 LIPUS 治疗（对照组，每周 3 次）。

冠状动脉造影和左心室造影

全身肝素化（30,000 U/体 IV）后，我们使用电影血管造影系统（东芝医疗系统公司，Ohtawara，日本）以左斜视图进行冠状动脉造影和左心室造影（各 n = 9）[4]。我们通过 Rentrop 评分半定量评估了 LCx 区域的侧支血流程度（0，没有可见的侧支血管；1，主要心外膜血管的侧支微弱充盈，但未充盈主血管；2，部分充盈心外膜血管）。主心外膜血管；3，主血管完全充盈）[15]。我们还计算了 LCx 区域可见冠状动脉的数量。为了比较给定时间侧枝发育的程度，我们选择了首先可视化整个左冠状动脉前降支（LAD）的框架[4]。

超声心动图评估

我们在 ameroid 植入前（基线）以及术后 4 周和 8 周进行了经胸超声心动图研究（各 n = 9）。为了评估局部心肌功能，我们使用以下公式计算壁增厚分数（WTF）；WTF = 100×(收缩末期壁厚−舒张末期壁厚)/舒张末期壁厚[4]。

局部心肌血流量的测量

我们在植入后第 4 周和第 8 周（各 n = 7）评估了彩色微球（Dye-Trak；Triton Technology，圣地亚哥，CA）的局部心肌血流量 (RMBF) [4]。由于技术问题，每组有2个样品被排除。我们通过左心房注射微球，并使用抽吸泵以 20 ml/min 的恒定速率持续 60 秒从降主动脉抽吸参考动脉血样。我们通过氢氧化钾消化从左心室 (LV) 壁和血液样本中提取微球，用二甲基甲酰胺 (200 µl) 从球中提取染料，并通过分光光度法测定其浓度[16]。我们计算了心肌血流量（ml·min ⁻¹ ·g ⁻¹) 的 LCx 区域和 IVS 区域[4]。

因子 VIII 染色

我们用兔抗因子 VIII 抗体（N1505；Dako，哥本哈根，丹麦）处理石蜡包埋切片。我们在 x400 放大倍率下计算了每颗心脏缺血性左室侧壁（LCx 区域）和非缺血性室间隔 (IVS)（LAD 区域）10 个视野中的因子 VIII 阳性细胞数量（每个区域 n = 7）[ 4]。

体内蛋白质印迹分析

来自缺血性 LCx 区域和非缺血性 IVS 区域的切片用于蛋白质印迹分析（各 n = 5）。通过电化学发光Western blotting luminal试剂（Santa Cruz Biotechnology）使含有VEGF、eNOS和bFGF蛋白的区域可视化。VEGF、eNOS 和 bFGF 的范围通过 3-磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH) 的范围进行标准化[4]。

统计分析

结果表示为平均值±SEM。两组之间的参数比较通过未配对的学生 t 检验进行。通过单向方差分析（体外研究）或双向方差分析（体内研究）分析数据，然后进行 Tukey 的 HSD 测试进行多重比较。P < 0.05的值被认为具有统计显着性。

LIPUS 声压

当循环次数从1增加到16、32、48和64时，1.875 MHz换能器产生的峰值声压分别从1.59下降到0.77、0.56、0.43和0.36 MPa（表S1）。施加到每个换能器元件的电压和声压之间的关系如图S1所示。在测试的条件中，当循环数为32时，估计的Ispta最高（表S1）。

LIPUS 对 HUVEC 中 VEGF、Flk-1 和 bFGF mRNA 表达以及 eNOS 活性的影响

根据上述初步数据（表S1），LIPUS处理显着上调HUVEC中VEGF的mRNA表达，在32个周期时效果最大（增加1.33倍，P<0.05）（图1）其受体 Flk-1 的表达没有增强（对照，1.00±0.06 vs. LIPUS，1.01±0.10；32周期）。尽管 32 个周期的 LIPUS 治疗并未上调 bFGF 的 mRNA 表达，但 HUVEC 中磷酸 eNOS 与总 eNOS 的比率（p-eNOS/总 eNOS）（eNOS 激活的标志物）显着增加（1.43 -倍增加，P<0.05）（图S2）。

LIPUS 疗法对缺血性心肌功能障碍的影响

ameroid 植入后 4 周（Pre-Tx），左心室造影显示两组 LVEF 均降低（图 3A 和 3B）。第 8 周（Tx 后）时，对照组 LVEF 保持不变（45.6±4.6 至 46.9±5.6%，P = 0.33）（图 3C），而 LIPUS 组则正常化（46.0±4.1 至 56.6±） 5.2%，P<0.05）（图3D）。治疗后 4 周，LIPUS 组 LVEF 的绝对改善（本研究的主要终点）显着高于对照组（46.9±5.6 至 56.6±5.2%，P<0.05）（图 3E ）。我们还通过经胸超声心动图连续测量了 LCx 区域（左室侧壁）的 WTF。虽然两组的 WTF 在 4 周时均降低（对照，21.6±2.7 vs. LIPUS，20.6±9.4%），但 LIPUS 组的 WTF 显着改善，但在对照组中在 8 周时保持不变（对照，18.2） ±8.0 vs. LIPUS，34.8±9.8%，P < 0.05）（图 4）。左心室造影和超声心动图的详细数据见表S2。

LIPUS 疗法的血管生成作用

两组之间的冠状动脉优势没有差异；对照组中，右主导型 0 例，平衡型 7 例，左主导型 2 例，LIPUS 组中右主导型 0 例，平衡型 7 例，左主导型 2 例[17]。ameroid 植入后 4 周，冠状动脉造影显示 LCx 完全闭塞，对照组（图 S3A）和 LIPUS 组（图 S3B）通过侧支血管灌注严重延迟。然而，在第 8 周时，LIPUS 组（图 S3D）而非对照组（图 S3C）显示缺血 LCx 区域冠状动脉侧支血管明显发育，Rentrop 评分增加（图S3E）以及该区域可见冠状动脉数量的增加（图S3F）。因子VIII染色显示因子VIII阳性毛细血管的数量仅在LIPUS组中增加(图5A和5B )。定量分析显示，8周时LIPUS组缺血侧壁区域毛细血管数量显着高于对照组（Control，858±151 vs. LIPUS，1084±175/mm ²，P < 0.05） ，而两组的非缺血 IVS 区域没有变化（对照，751±20 与 LIPUS， 785±45/mm ²，P  =  0.27）（图5C）。

LIPUS 治疗对局部心肌血流的影响

4 周时，两组外侧壁的 RMBF 均等下降（对照，0.84±0.29 对比 LIPUS，0.78±0.22 ml/min/g，P  =  0.35），但 IVS 中仍保持正常（对照，1.91± 0.59 对比 LIPUS，1.89±0.53 毫升/分钟/克，P  =  0.47）。8周时，LIPUS治疗显着改善了侧壁的RMBF（对照，0.97±0.36 vs. LIPUS，1.39±0.35 ml/min/g，P < 0.05）（图6A），而在非治疗组中则保持不变。尽管进行了 LIPUS 治疗，两组仍出现缺血性 IVS（对照，2.04±0.69 vs. LIPUS， 2.19±0.77ml/min/g，P  =  0.36）（图6B）。

LIPUS治疗对VEGF、eNOS和bFGF表达的影响

5周时的Western blot分析表明，尽管经过LIPUS治疗，但LIPUS组侧壁中VEGF、eNOS和bFGF的蛋白表达显着上调，而两组非缺血IVS区域中的蛋白表达均无变化（图7）。

LIPUS 疗法的安全性

LIPUS 未发现不良血流动力学变化或皮肤或肺部组织学损伤。

LIPUS 对体外内皮再生的增强作用

我们的设备用于诊断的脉冲超声周期数为 1 个周期，而我们在本研究中出于治疗目的测试了更多周期数（16、32、48 和 64）。当LIPUS应用于HUVEC时，上调VEGF mRNA表达的最大效果在32个周期时达到。峰值声压随着循环次数的增加而降低，而施加到每个换能器元件的电压的升高受到超声探头的温升的限制，尽管较高的电压可能引起更高的峰值声压。因此，在本研究中，当 LIPUS 在 32 个周期应用时，获得了最高估计的 Ispta。本研究中使用的超声强度相当于超声诊断设备的强度，而更高强度的超声用于溶栓或肿瘤消融（高强度聚焦超声，HIFU）[9] .尽管我们证实了 LIPUS 在 32 个周期的体内有益作用，增强了血管生成并改善了左心室心肌功能障碍，但仍需进一步检查更高的 Ispta 或 32 个周期本身哪个更重要。这一点需要在未来的研究中进行检验。

LIPUS 疗法对 IHD 的有益作用

在本研究中，我们证明LIPUS疗法（1）使体内整体和局部心肌功能正常化，（2）增加慢性缺血区域的毛细血管密度和RMBF，且没有任何副作用，以及（3）增强VEGF的蛋白水平缺血心肌中的 、 eNOS 和 bFGF 不影响非缺血心肌中的那些。这些结果表明，LIPUS疗法是治疗缺血引起的心肌功能障碍的有效且安全的治疗策略。

LIPUS 诱导血管生成的潜在机制

我们证明，LIPUS 在体外上调 VEGF 表达和 eNOS 活性，并在体内增强血管生成，并与猪体内 VEGF、eNOS 和 bFGF 蛋白表达增强相关。巴泽莱等人。还报道LIPUS在大鼠后肢缺血中诱导血管生成和VEGF上调[10]。eNOS 具有血管舒张和血管生成作用[18]，而 bFGF 已知可在伤口愈合过程中介导新血管形成[19]。因此，表明 LIPUS 疗法通过增强多种血管生成途径来改善心肌功能。然而，目前尚不清楚LIPUS如何单独调节缺血心肌中血管生成因子的表达。

本研究中，体外 HUVEC 中单次 LIPUS 治疗 20 分钟后 VEGF mRNA 表达增加的程度相当小，而 LIPUS 治疗后（每周 3 次）VEGF 蛋白表达增加两倍以上）体内（增加2.19倍，P<0.05；图7B）。此外，LIPUS治疗在体外没有上调bFGF的mRNA表达，而LIPUS治疗在体内显着增强bFGF的蛋白表达。这些结果表明，重复治疗比单次治疗更能上调血管生成因子。另一种可能性是内皮细胞和其他类型细胞之间的细胞间相互作用对于增强多种血管生成途径很重要[20] 。骨髓来源的祖细胞和驻留干细胞已被证明有助于血管生成过程[21]。徐等人。据报道，LIPUS 在体外刺激造血干/祖细胞的活力、增殖和分化[22]。富山等人。还报道了 LIPUS 应用于循环血管生成细胞增强了它们的生成和迁移能力[23]。因此，LIPUS可能直接和/或间接影响未成熟细胞的功能和动力学，例如骨髓源性单核细胞和驻留心脏干细胞[24]。

LIPUS 对左室功能障碍产生有益作用的其他潜在机制

既往研究表明，LIPUS 可刺激血管生成细胞因子（例如 IL-8、bFGF 和 VEGF）的产生[25]，并减少 COX-2 和 PGI ₂的产生[26]，并且低能量 SW 疗法发挥多重作用，包括血管生成、抗炎、抗氧化和抗凋亡作用[4] – [8] , [27]。因此，与低能量 SW 疗法一样，血管生成以外的机制也可能有助于本研究中 LIPUS 的有益作用。这一点还有待在未来的研究中进行检验。

LIPUS 对单细胞水平的影响

已知机械刺激会影响内皮细胞功能和内皮细胞膜上的机械传感器，例如整合素和小窝蛋白[28]，[29]。据报道，超声照射会对内皮细胞产生剪切应力[11]。此外，据报道，由剪切应力诱导的对培养的内皮细胞的机械刺激可以增强内皮细胞的增殖、迁移和出芽[30]。此外，超声波已被证明可以诱导内皮细胞膜上的声孔作用，导致钙离子流入[31]。因此，可以想象，多种机制，例如机械传感器的触发、内皮细胞生长的激活和声孔激活的改变，有助于LIPUS诱导的血管生成。需要进一步研究。

SW疗法与LIPUS疗法的比较

我们之前已经证明，在慢性心肌缺血的猪模型中，低能量心脏SW疗法可有效诱导新生血管形成并改善心肌功能[4]。基于动物研究中令人鼓舞的结果，我们开发了低能量SW疗法，其中低能量SW疗法改善了严重心绞痛患者的症状和心肌灌注[5] – [8]。我们还证明，低能量 SW 疗法可以改善外周动脉疾病 (PAD) 和间歇性跛行患者的行走能力[32]。此外，我们最近证明低能量 SW 疗法可诱导治疗性淋巴管生成，增强皮肤伤口愈合并改善脊髓损伤后的运动恢复[33] – [35]。由于 SW 和超声波有相似之处，因为它们同样直接穿过身体组织（脂肪、肌肉、体液等），因此我们测试了 LIPUS 作为一种非侵入性血管生成疗法治疗缺血性心脏病的潜在用途。在本研究中，我们能够证明LIPUS在一定照射条件下有效增强血管生成细胞因子的表达并显着改善体内缺血引起的心肌功能障碍。由于LIPUS治疗缺血心肌与低能量SW治疗同样有效[4]，因此LIPUS治疗和低能量SW治疗可能激活共同的信号通路。

本研究中使用的超声波强度在美国食品和药物管理局定义的诊断超声波设备的声输出标准的范围内。由于目前LIPUS系统的特点是使用相同的探头进行诊断和LIPUS治疗，这使得LIPUS治疗装置比SW治疗装置更容易操作，因此，LIPUS治疗有望成为一种新的治疗方法。，非侵入性血管生成治疗，因为超声诊断设备已经在世界范围内广泛使用。

临床意义

如上所述，LIPUS 疗法预计对 IHD 患者有效。与照射聚焦区域的SW不同，LIPUS不仅照射缺血区域，还照射非缺血区域。然而，LIPUS 疗法仅增强缺血区域的血管生成，而没有副作用。我们认为这种新的LIPUS疗法应该首先应用于没有PCI或CABG指征的症状性心绞痛患者。LIPUS 疗法也有望像低能量 SW 疗法一样对间歇性跛行或难治性皮肤溃疡的 PAD 患者有效[32] – [34]。

研究局限性

应该提到本研究的几个局限性。首先，我们在诊断设备的声输出标准强度内优化了超声波的设置，因为较高的超声波强度会导致探头温度升高，从而可能导致烧伤。为了安全起见，我们没有检查更高强度的超声波，以防止因产生热量而灼伤皮肤。其次，在本研究中，根据我们之前的心脏 SW 治疗研究，我们每周进行 3 次 LIPUS 治疗[4]、[5]、[7]、[36]、[37]并观察到 LIPUS 疗法对缺血引起的左心室功能障碍的有益作用。但目前尚不清楚3次是否为最佳治疗次数。这一点还有待在未来的研究中解决。

结论

在本研究中，我们能够证明非侵入性 LIPUS 治疗可增强多种血管生成途径，有效增加毛细血管密度和局部心肌血流量 (RMBF)，并使缺血引起的心肌功能障碍正常化，且无任何副作用。因此，这些结果表明 LIPUS 疗法可能是 IHD 的有效、安全和非侵入性疗法。