聚焦冲击波和惯性空化从肾细胞癌中释放肿瘤相关抗原

2.1 .细胞系

本研究中使用的两种人肾癌细胞系是 TOS-1 和 ACHN 细胞。TOS-1 细胞系源自 RCC 患者的转移组织，由东北大学泌尿外科开发[5]。从 RCC 患者恶性多发性积液中获得的 ACHN 细胞系购自美国组织培养物保藏中心 (ATCC)。两种细胞均在补充有 10% 胎牛血清 (FBS)、1% 青霉素/链霉素和 1% L-谷氨酰胺（均来自美国纽约州 Gibco）的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (MEM) 中，在 5% 的潮湿气氛中培养。37°C 时的二氧化碳。

2.2 .单克隆抗体

两种一抗单克隆抗体 (mAb) mAb-RM1 和 mAb-RM2 由 M. Satoh 博士（日本仙台东北大学医学院泌尿系）友情提供[17]。一抗 mAb-RM1 用于测量 ACHN 细胞上单唾液酸半乳糖基球苷抗原 (MSGG) 的表达[18]，而 mAb-RM2 测量 ACHN 细胞上单唾液酸半乳糖基球苷抗原 (MSGG) 的表达水平TOS-1 细胞上的二唾液酸神经节苷脂 GalNAcDSLc4 抗原或 G1 [6]使用山羊产生的抗小鼠 IgM 抗体（Sigma-Aldrich，达姆施塔特，德国）作为阴性对照。

2.3 .冲击波仪

如前所述[16]，使用内部设计的设备产生冲击波。简而言之，它由放置在充满 30°C 脱气水的水浴中的部分球形压电陶瓷盘（内径 125 毫米，深度 16 毫米）组成。图1A说明了实验装置。图 1 B 显示了在焦点处测量的 0 μs 和 103 μs 的压力-时间历史的放大视图。压力通过具有0.5mm直径敏感区域和50ns上升时间的针式水听器（Muller-Platte针式探头，德国）测量。-2.5 MPa 的负压先于激波前沿，这是由于压电陶瓷元件的收缩而产生的。随后是 16 MPa ( P max），脉冲持续时间为 0.6 µs，正能量通量密度为 0.04 mJ mm −2。冲击波之后是负压为-2 MPa、持续时间为1.8 μs、负能量通量密度为2 μJ.mm -2的拉伸波[16]。激波后面的张力波是由压电陶瓷盘开口处的膨胀波引起的，该膨胀波因波会聚而增强，并在焦点区域引起惯性空化[19]。空化泡的破裂在 103.8 μs 处引发了 1.5 MPa 的正压脉冲。图1C示出了垂直于轴线的焦点处压力的径向分布。焦点周围，焦区轮廓（冲击波最大超压比的50%P/P max  = 1/2或-6 dB)具有径向半径为1.5mm、轴向长轴长度为13mm的对称椭圆形状。因此，聚焦区的体积约为60μl。冲击波压力具有高度可重复性（峰值压力的±5%），因此细胞在每次暴露期间都暴露于相同的波剖面。

2.4 .冲击波治疗

用0.02％EDTA溶液(Gibco，Thermo Fisher Scientific Inc.Grand Island，NY)处理培养的细胞，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤并在MEM培养基中收集至1x10 6 个细胞/ml。将总共2ml细胞悬液转移至内径13mm的聚乙烯管中进行冲击波处理。为了确保最大的冲击波传播和最小的反射，管的底部被切割并用与介质具有相同声阻抗的 25 µm 聚乙烯薄膜薄层密封。通过使用XYZ测微计定位台（Sigmakoki Co.，日本），将含有细胞的管精确定位在冲击波发生器的焦点区域中。图1A 说明了悬浮细胞的位置。实验中使用的冲击波数量先前是根据导致处理细胞的细胞活力 (LD50) 损失 50% 所需的冲击波量确定的[16]。因此，悬浮细胞在 16 MPa 压力下暴露于 1,000 次重复频率为 5 Hz 的冲击波 (+SW) [16]。对假对照细胞（-SW）进行类似处理，但没有冲击波暴露。

2.5 .流式细胞术

使用一抗（mAb）和碘化丙啶（PI）的双染色流式细胞术来测量活细胞表面上目标抗原的表达。使用 FITC 标记的初级 mAb-RM1 测定 ACHN 细胞上的 MSGG 表达水平。FITC 标记的原代 mAb-RM2 用于测量 TOS-1 细胞上 G1 的表达水平[5]。简而言之，将 500 µl 细胞悬浮液（ACHN 或 TOS-1）与 50 µl 相关初级 mAb（mAb-RM1 或 mAb-RM2）在 4 °C 下孵育一小时，用 PBS 洗涤缓冲液洗涤两次（ 1%BSA/PBS 和 0.05%NaN 3），用 50 µl 荧光素 (FITC) 缀合的抗小鼠 IgG + IgM（Sigma Chemical Co.，Japan）在冰上避光处理 1 小时，用 PBS 洗涤两次，与 20 µl PI（Sigma Chemical Co.，Japan）一起孵育。，日本）30 分钟，悬浮于 300 µl 异酮溶液（Becton Dickinson，桑尼维尔，加利福尼亚州，美国）中，最后通过 FACScan cellQuest 进行测量流式细胞仪（Becton Dickinson，圣何塞，加利福尼亚州，美国）。从最终结果中减去在 PBS 中的一组悬浮细胞中测量的自发荧光信号（未用任何抗体标记它们）。使用 CELLQuestTM 软件对每个样本至少 10,000 个事件进行数据分析。在冲击波暴露后立即测量抗原的表达水平。除了冲击波之外，假暴露的样品以相同的方式进行处理。

对于阴性对照，如上所述制备样品，而不与相关的一抗一起孵育。

2.6 .神经节苷脂的提取和纯化

如前所述从细胞中提取糖脂[5]。简言之，用PBS洗涤约500mg堆积的细胞(1×10 8 个细胞)。使用 15 体积的异丙醇/己烷/水（55:25:20，v/v/v）和氯仿甲醇（2:1、1:1 和 1:1）均化和过滤，从细胞沉淀中提取粗糖脂。2 v/v）。将萃取液蒸发并通过 Folch 分配法分离为上相和下相[20]。然后将上层相用蒸馏水透析 2 天，并通过 DEAE-Sephadex-A25（Pharmacia，乌普萨拉，瑞典）柱色谱分离为上层中性糖脂和酸性神经节苷脂级分[21]。使用在氯仿溶剂系统中开发的微量注射器，将含有从相同湿重的细胞中提取的神经节苷脂的酸性组分与标准神经节苷脂一起放置在高性能薄层色谱（HPTLC）板（美国新泽西州贝克）上。甲醇-0.5% CaCl2 水溶液 (50:40:9 v/v/v)，并通过喷洒 0.5% 苔黑酚硫酸溶液进行可视化（苔黑酚-H2S04）。

2.7 .薄层色谱 (TLC) 免疫染色

如先前所述进行TLC免疫染色[22]。根据 Magnani 程序的修改版本对 HPTLC 板进行免疫染色。简而言之，使用含有 0.05% CaCl 2的氯仿甲醇水 (CMW) 50:40:10 溶剂系统将总神经节苷脂级分应用于 HPTLC 板上。将板风干并浸入高分子量 0.5%-聚甲基丙烯酸异丁酯 (PITM)（Sigma-Aldrich Chemical Co., WI, USA）的乙醚溶液中 1 分钟，并在室温下用 5% BSA/PBS 封闭 1 小时，然后与一抗单克隆抗体 mAb-RM1（抗 MSGG）或 mAb-RM2（抗 G1）以及非免疫小鼠 IgM 在 4 °C 下反应过夜。然后用冷PBS洗涤板3次，并与生物素化抗小鼠IgM（Sigma-Aldrich Chemical Co.，WI，USA）作为二抗在室温下孵育1小时。然后用载体抗生物素蛋白-生物素溶液将板染色30分钟，最后用3',3-二氨基联苯胺染色。TLC 免疫染色数据通过 ImageJ 图像处理程序进行分析以进行定量测量[23]。

2.8 .扫描电子显微镜

冲击波处理的细胞立即在2.5%戊二醛加2%多聚甲醛中固定2小时，然后在1%四氧化锇溶液中后固定1小时。在上升的乙醇系列中脱水后，用临界点干燥器（日立，东京，日本）用液体CO 2干燥细胞并用铂-钯（Pt-Pd）溅射。在LEM1200EX扫描电子显微镜（JEOL，东京）下将冲击波处理的细胞的形态与对照进行比较。

2.9 .免疫电镜

通过预包埋间接免疫过氧化物酶方法将膜 GSL 抗原定位于亚细胞空间[24]。简而言之，将细胞沉淀在 4% 多聚甲醛/0.05 M 磷酸盐缓冲液中固定 2 小时。在 10%、15% 和 20% 蔗糖/PBS 中连续洗涤后，将细胞沉淀包埋在 OCT 化合物中，冷冻在干冰-乙醇中，并储存在 –80 °C 下。将细胞沉淀的冷冻切片（5 µm 厚）安装在白蛋白包被的载玻片上，浸入 1% BSA/PBS 中，并与第一个 mAb-RM1 在 4 °C 下孵育 12 小时，然后与过氧化物酶孵育过夜抗小鼠 IgM 的缀合 F(ab')2 片段用含有 10% 正常人血清的 PBS 按 1:100 稀释，作为二抗（Histofine Kit SAB-PO；Nichirei Co.，日本东京）。使用二氨基联苯胺 DAB（Dojin，熊本，日本）作为色原，浓度为 30 mg/100 ml Tris-HCL 缓冲液，含 0.006 % H 2 O 2。为了最大限度地降低内源性过氧化物酶活性，将 65 mg/100 ml 叠氮化钠添加到 DAB 中。随后通过将样品与 1% 四氧化锇一起孵育 20 分钟来观察与 DAB 的反应。乙醇脱水后，将超薄切片包埋在Epon中，用柠檬酸铅包被，并用LEM1200EX扫描电子显微镜（JEOL，东京）观察。通过 ImageJ 分析图像，以定量测量细胞膜中表达的抗原的强度[23]。

2.10 .统计分析

使用不配对t检验（包括韦尔奇校正）对数据进行分析。数据代表三个独立实验的平均值±SD。当校正的 P 值小于 0.05 时，结果被认为是显着的，在图例中表示为 P<0.05。

3.1 .流式细胞术测量

使用 PI 及其各自的一抗单克隆抗体 mAb-RM1 和 mAb-RM2，通过双染色流式细胞术监测 ACHN 上 MSGG 抗原和 TOS-1 细胞上 G1 抗原的膜表达。对照 ACHN（图 2A，a）和 TOS-1 细胞（图 2C ，c）中抗原表达的点图和直方图分析与冲击波处理的 ACHN 上的表达（图 2C）进行比较。2 B、b) 和 TOS-1 细胞（图 2 D、d）。

根据 PI 强度 (FL2-Hight)，将每个样本中的细胞总数分为 PI 阳性 (R3) 和 PI 阴性（R1 和 R2）区域（图 2 A – D）。从抗原分析中消除死细胞，然后仅使用 R1 和 R2 区域门控的细胞子集来测量 MSGG 或 G1 抗原 (FL1-Hight) 的表达（图 2 a – d）。对于每个样本组，ΔM 计算如下：(1)其中M1 (-SW)代表假对照组细胞样本上的抗原表达，而M1 (+SW)代表冲击波处理后的表达。

如图2b和d所示，细胞表面MSGG和G1的抗原表达在冲击波之后立即减少。与对照细胞相比，ACHN 细胞中的 MSGG 表达平均减少了三分之一 (29.41% ± 0.45%)（图 2a和 b）。类似地，TOS-1细胞上G1的表达水平降低了约17.57%±0.45%（图2c和d）。

3.2 .薄层色谱分析

TLC 分析中的免疫染色通常涉及使用抗体来检测 TLC 板上分离的特定化合物。

在这里，从 ACHN 和 TOS-1 细胞的细胞膜中提取 GSL 并 TLC 分离 GSL 化合物后，通过使用相关的初级 mAb-RM1 对抗原进行免疫染色来定量测量样品中目标抗原的密度。或单克隆抗体-RM2。与对照相比，样品的 TLC 分析显示，冲击波处理的 ACHN 和 TOS-1 细胞中 MSGG 和 G1 分数分别下降了 49.30% 和 57.08%（图 3 A – D）。

3.3 .免疫电镜分析

对照 TOS-1 细胞的免疫电子显微镜图像显示 G1 抗原作为细胞膜中的电子致密沉积物（图 4 A）。对照细胞的放大图像显示出高度免疫染色的囊泡结构（50-100 nm），紧邻细胞膜（图4a）。然而，对照细胞的细胞质中几乎不存在抗原。

冲击波和空化后立即处理的细胞的图像显示，根据损伤的严重程度，发生了各种形态变形，从可逆的膜损伤到细胞的完全破裂。气泡形成以及受损细胞膜中膜碎片的释放。此外，冲击波处理的细胞表现出细胞质的空泡化，其中细胞质膜结构相互连接并在细胞质中形成更大的结构（图4B，b）。

冲击波后，细胞膜和囊泡结构中检测到的 G1 抗原的密度显着下降（图 4 B，b）。冲击波暴露还导致囊泡结构与细胞膜连接。相比之下，G1 在与处理细胞的细胞膜分离并释放到细胞外空间的气泡和碎片中高度表达。此外，图像没有显示任何抗原引入到处理细胞的细胞质中。

3.4 .形态分析

悬浮液中对照TOS-1细胞的扫描电子显微镜图像显示球形细胞表面覆盖有丰富的微绒毛（图5A）。

在冲击波和空化暴露后，经过处理的细胞根据损伤的严重程度表现出各种形态变形；例如细胞膜凹陷（图5B）、细胞拉长和气泡形成（图5C）。聚焦冲击波和空化冲击波对细胞膜的冲击导致细胞膜沿冲击波方向凹陷，如图 5 B 和 C 所示。可以看到经过处理的细胞表面微绒毛数量减少由于底层细胞骨架受损。

3.5 .量化聚焦冲击波参数

在这项研究中，在16 MPa压力和0.04 mJ mm -2能量通量密度下施加聚焦冲击波。这相当于临床体外冲击波治疗中常用的7至80 MPa压力和0.004至0.6 mJ mm -2能量通量密度[25]、[26]。在1,000次聚焦冲击波脉冲后，细胞悬浮液经受每体积0.43 J ml -1的总能量。根据细胞悬浮液的比热容 4.217 Jg -1 .K -1 [27]，该能量会导致温度升高约 0.1 °C。在我们的测量中，暴露于冲击波后样品的总体温度没有明显增加。因此，在当前的研究中，体热效应很小且不显着。

冲击波的焦点体积为 60 μl，而悬浮细胞的体积为 2 ml。悬浮细胞的运动也没有限制。结果，在一次暴露期间，只有一小部分细胞（3%）暴露于聚焦冲击波。换句话说，单个悬浮细胞在 1,000 次冲击波暴露期间平均承受 30 次焦点压力。该数字与通常应用于培养细胞的 10 至 30 次冲击波的数字相当[26]、[28]。

焦点区域的平均冲击波压力为8 MPa（图1 C），根据细胞介质的冲击Hugoniot方程[16]，[29]，[30]将产生5.3 ms -1的粒子速度或微流。。在冲击波脉冲的半峰全宽 (FWHM) 持续时间为 0.32 μs（图 1 B）期间，微流引起的平均颗粒位移为 1.7 μm [31]、[32]。在某种程度上，这种颗粒运动可能有助于碎片与细胞的分离，如图4 B-b 所示。

3.6 .冲击波在细胞中传播的动力学

从物理角度来看，与冲击波（无论是直接冲击波还是空化引起的空化）对细胞的影响相关的重要参数之一是它们对几何形状和非均匀结构的主要影响[33]、[34]、[35]。细胞介质中的激波前沿厚度约为1至2 nm，约等于水分子的几个平均自由程[36]，小于细胞膜厚度5至10 nm（包括脂质双层和嵌入的蛋白质） ）[36]。当激波前沿撞击细胞时，它会在细胞膜和亚细胞结构上反射、折射和衍射。含有脂质的细胞膜的声阻抗约为1.38 MRayl（密度为952 kg.m -3，声速为1,459 ms -1）[37]。细胞质的声阻抗为 1.60 MRayl（密度 1,032 kg.m −3，声速 1,550 ms −1）[38]，而细胞周围介质的阻抗为 1.499 MRayl（密度 1,007 kg.m −3，声速1,550 ms −1 ）。声音 1,489 ms −1 ) [29] , [39]。因此，当细胞内传输的冲击波与膜相互作用时，它会反射为膨胀（稀疏）波。图6示出了基于上面提供的描述的冲击波/细胞相互作用动力学模型。

在冲击波聚焦过程中，冲击波前端从会聚（凹）形状演变为焦点处近乎笔直的形状，然后以发散（凸）形状传播[19]。因此，冲击波的曲率半径为毫米级（1.5毫米焦区半径，图1A），比细胞直径（R细胞 = 5微米）高两个数量级。因此，与单元尺寸相比，在图6的模型中忽略了入射冲击波的曲率半径。该模型也适用于与细胞相互作用的点源冲击波，例如激光或空化，其中冲击波曲率、速度和压力随传播的变化使计算变得复杂。

反射压力和透射压力可以从压力反射关系[32]、[37]获得：(2)磷�磷我=�2/因斯��-�1/因斯�我�2/因斯��+�1/因斯�我,磷�磷我=2�2/因斯���2/因斯��+�1/因斯�我,其中P r、P t和P i分别是反射、透射和入射压力，Z 2和Z 1是透射和入射介质的声阻抗，θ i和θ t分别是入射和透射波的角度。假设垂直入射 ( θ i  =  θ )，细胞质内传输的冲击波（图 6 A 和 B）从膜反射（图 6 C），平均入射压力为 8 MPa，负压为 -0.60 MPa t = 0）。这种张应力导致TOS-1 和 ACHN 细胞膜中的侧向张力τ（τ  =  RP，其中R是细胞半径，P是压力）等于 3.0 Jm -2 （R细胞 = 5 μm）[40 ]。典型的细胞质膜（红细胞[40]）在实验室时间尺度上的横向张力为 0.01–0.023 Jm -2时破裂，基于膜的临界面积应变为 2–5% [31] , [40]。虽然平均拉伸波产生的侧向张力比典型细胞膜破裂张力高两个数量级，但拉伸波载荷的 0.32 μs FWHM 时间尺度（图 1 B）比实验室小六个数量级时间尺度[40]。应力加载的持续时间短可以解释为什么反射膨胀波的拉伸应力发生改变（图4）但没有使细胞膜破裂（图5）。

反射的膨胀波具有凹形，这是由细胞膜的接近球形的几何形状引起的（图6C）；因此，当它在影响细胞内细胞器的细胞质内传播时，它会收敛并增加其压力幅度和能量密度。冲击波使细胞形状沿相互作用方向变形，使上游膜变平并拉伸下游膜，如图6 D 所示。据估计，这些变形是冲击波后面粒子运动的结果[30]冲击波微流为 1.7 μm。这可以解释图 5 B 和 C中处理细胞的扫描电子显微镜图像中观察到的变形机制。

冲击波通道脉冲加速细胞膜和细胞质之间的界面，从而引起界面（Richtmyer-Meshkov）不稳定性[41]，[42]。这种不稳定性是由激波上的压力梯度和膜上的密度梯度之间的耦合造成的。所谓斜压涡度的感应。这种不稳定性会扰乱细胞膜并产生气泡和渗透膜的液体尖峰，进而导致细胞的细胞质和细胞外液的混合。

此外，粘附在刚性表面（例如载玻片、骨头或石头）上的细胞的冲击波效应机制[28]、[43]、[44]与悬浮细胞或具有细胞间粘附的组织的冲击波效应机制不同。虽然这里解释了冲击波（直接的或空化诱导的）对介质（或组织或肿瘤）中的细胞的影响机制，但对于粘附在刚性边界上的细胞，由于固体之间显着的声阻抗不匹配，强烈的冲击波反射流体以及冲击/边界层相互作用（在刚性表面上）是细胞损伤的主要机制。

聚焦冲击波后面的负压稀疏波可能引起惯性空化，这也影响了细胞。在惯性空化过程中，空化气泡增大、过度膨胀，然后收缩。气泡破裂最后阶段的能量集中产生等离子体，导致局部冲击波（图 1 B，103 μs）、紫外线 (UV)、自由基和活性氧 (ROS)，所有这些都会影响附近的细胞。焦点扩展[26]，[44]。由于存在刚性或粘弹性边界，气泡破裂会产生强烈的液体射流，刺穿细胞。这会导致不可逆的穿孔和细胞死亡[43]。然而，在当前的悬浮细胞设置（没有刚性边界）中，液体射流效应很小且可以忽略不计[31]。