前言
2024年9月17日，来自中国和美国的研究团队在国际知名医学期刊「Journal of Clinical Investigation」（IF=15.9）发表题为「Reversible cold-induced lens opacity in a hibernator reveals a molecular target for treating cataracts」即「冬眠动物中可逆性的寒冷诱发的晶状体混浊揭示了治疗白内障的分子靶点」的研究论文。研究发现RNF114 在逆转地松鼠低温晶状体混浊方面发挥关键作用，可能成为白内障治疗的新靶点。
本研究浙江大学医学院附属第二医院眼科中心与美国国立卫生研究院（NIH）国家眼科研究所（NEI）视网膜神经生理科为第一作者单位，浙江大学医学院附属第二医院眼科中心为通讯作者单位。北京大学生命科学学院、浙江大学医学院儿童医院眼科、浙江省人民医院眼科共同参与了研究。浙江大学医学院附属第二医院眼科中心 杨昊 博士和 NEI 的 Xiyuan Ping 博士为共同第一作者，浙江大学医学院附属第二医院眼科中心申屠形超教授为通讯作者。
摘 要
研究背景
蛋白质稳态（proteostasis）对维持细胞正常功能至关重要，其失衡与多种疾病相关，包括白内障。
冬眠动物是天然的冷应激适应者，但它们在剧烈温度变化下维持蛋白质组平衡的机制尚不清楚。
地松鼠（GS）的晶状体在冬眠 - 复温过程中具有可逆性的晶状体混浊现象，与白内障相关。
研究目的
探索 GS 晶状体逆转晶状体混浊的机制，寻找治疗白内障的分子靶点。
研究方法
建立 GS iLEC 平台：通过将 GS 来源的诱导多能干细胞（GS iPSCs）分化为 GS 诱导晶状体上皮细胞（GS iLECs），创建了用于研究低温白内障的平台。
蛋白质组学分析：使用 TMT - 液相色谱 - 串联质谱（LC - MS / MS）对 GS 和大鼠晶状体囊组织进行蛋白质组学分析。
细胞实验：进行细胞培养、转染、低温 - 复温处理、免疫荧光染色、共免疫沉淀（co - IP）、蛋白质印迹等实验。
动物实验：建立大鼠低温性白内障模型和斑马鱼氧化应激性白内障模型，进行药物治疗实验。
研究结果
1. GS 晶状体混浊的可逆性：在低温 - 复温循环中，GS 晶状体混浊被逆转，而大鼠晶状体的混浊则持续较长时间。
图1:在低温复温循环过程中，GS 晶状体混浊情况发生逆转。
2. GS iPSCs 分化为 GS iLECs：建立了新的 4 阶段分化协议，成功将 GS iPSCs 高效分化为 GS iLECs，为深入研究提供了体外模型。
图2：GS iPSC 有效分化为 GS iLEC。
3. UPS 促进聚集晶状体蛋白的降解：在低温适应的晶状体中，泛素 - 蛋白酶体系统（UPS）相关的基因表达上调，UPS 促进了突变晶状体蛋白的降解，而自噬抑制剂对其无影响。
图3：UPS 促进聚集的晶状体蛋白的降解。
4. RNF114 促进 CRYAA 泛素化：鉴定出 RNF114 作为 CRYAA 的 E3 泛素连接酶，在低温 - 复温过程中促进 CRYAA 的泛素化和降解。
图4：RNF114 促进 GS iLEC 中低温复温过程中的 CRYAA 泛素化。
5. RNF114 在 HLECs 中促进 CRYAA 降解：在人晶状体上皮细胞（HLECs）中，RNF114 过表达可降低内源 CRYAA 水平，敲入 RNF114 WT 可消除 CRYAA 聚集。
图5：RNF114 促进 HLEC 中的 CRYAA 蛋白酶体降解。
6. RNF114 逆转非冬眠动物的白内障：RNF114 对 HLECs 和 GS iLECs 无细胞毒性，TAT - RNF114 可逆转大鼠低温性白内障和斑马鱼氧化应激性白内障引起的晶状体混浊。
讨 论
错误折叠或聚集的蛋白质需降解以维持蛋白质稳态，本文揭示了 GS逆转晶状体混浊的机制主要依赖于复温期间UPS对CRYAA聚集体的上调，新发现的RNF114在聚集体降解和周转中起核心作用，对不同应激性白内障模型有显著可逆性影响。
利用GS iPSC分化为GS iLEC，创建了晶状体研究平台，该平台为评估冷应激适应性提供了机会。
蛋白质稳态网络主要依赖UPS和自噬系统，UPS系统可能是维持冬眠动物蛋白质稳态的关键，而大鼠可能主要依靠分子伴侣活性维持蛋白质折叠。αA - 晶状体蛋白是唯一在低温 - 复温循环中形成聚集体的内源性晶状体蛋白，CRYAA聚集体可能是UPS的主要底物。
E3泛素连接酶RNF114能特异性识别CRYAA作为底物，促进其多泛素化和蛋白酶体降解。
研究团队在低温模型中使用了两种聚集蛋白模型：Y118D 和 WT CRYAA。两者都可以诱导白内障形成，并能被 RNF114 有效缓解。低温模型中的 WT CRYAA 聚集体可能是由于构象平衡被破坏或细胞对冷应激的反应所致，而 Y118D 是一种经临床验证的白内障相关 CRYAA 突变蛋白。值得注意的是，Y118D和WT CRYAA的聚集机制可能不同，RNF114对它们的降解效果也不同，需要进一步实验来区分其清除机制和聚集机制的差异。
为了增加晶状体中的药物浓度，研究团队设计了一种与 TAT 融合的 RNF114 肽，以增强其向晶状体的输送；合成的 TAT-RNF114 已被证明能逆转突变 CRYAA 的聚集，并减轻大鼠因寒冷和氧化性白内障引起的不可逆晶状体混浊。此外，这种方法已被证明可有效治疗 H 2 O 2诱发的斑马鱼模型中的相关白内障，这两种模型都是经过验证的白内障模型。因此，UPS 依赖的 E3 酶 RNF114 作为预防晶状体蛋白聚集的关键分子，为预防和治疗白内障提供了一种新策略。
综上，这些观察结果可能会促进对冬眠动物蛋白质稳态维持网络的新研究。筛选和设计刺激特定蛋白质降解途径的药物有助于精确调节蛋白质的稳定性和周转，从而有可能推动蛋白质稳态维持和蛋白质聚集性疾病治疗的进展。
研究局限
研究仅限于雄性大鼠和 GS，未涉及雌性，雌性大鼠的发情周期可能影响晶状体研究结果。
研究贡献
揭示了 GS 晶状体逆转混浊的机制，为治疗白内障提供了新的分子靶点和策略。
建立了 GS iLEC 平台，为深入研究低温白内障提供了有力工具。
总的来说，该研究结果重现了非冬眠动物中寒冷诱导的晶状体混浊的可逆性，从而为白内障临床应用带来了巨大的希望。
注：文末研究团队特别感谢西湖大学西湖实验室（西湖生命科学和生物医学浙江省实验室）的郭天南教授和 Xiao Yi 教授在蛋白质组学检测和分析方面的合作。这项工作得到了国家自然科学基金项目、浙江省自然科学基金项目、浙江省医药卫生科技计划项目和浙江省中医药科技计划项目的支持。这项研究部分得到了美国国立卫生研究院国家眼科研究所内部研究计划的支持。
结语
尽管目前的研究仍处于动物研究阶段，但对未来的临床应用和疾病治疗具有重要的指导意义。通过进一步探索，有望更深入地了解蛋白质稳态的机制，以及如何精确调节蛋白质的稳定性和周转。未来期待能筛选和设计出更多刺激特定蛋白质降解途径的药物，这将有助于推动蛋白质稳态维持和蛋白质聚集性疾病治疗的进展。特别是在白内障治疗方面，期待能基于 RNF114 等关键分子，开发出更有效的预防和治疗策略，为临床对抗白内障带来丰富的治疗选择。
本文文献：
Yang H, Ping X, Zhou J, Ailifeire H, Wu J, Nadal-Nicolás FM, Miyagishima KJ, Bao J, Huang Y, Cui Y, Xing X, Wang S, Yao K, Li W, Shentu X. Reversible cold-induced lens opacity in a hibernator reveals a molecular target for treating cataracts. J Clin Invest. 2024 Sep 17;134(18):e169666. doi: 10.1172/JCI169666. PMCID: PMC11405036.
