文献精读：外泌体包覆的氧纳米气泡水凝胶通过增强外泌体细胞内传递促进伤口愈合

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伤口愈合是一个重要的临床问题，受到不充分的血管生成、炎症和慢性缺氧的影响。伤口愈合的延迟会显著影响患者的生活质量，并增加医疗成本。外泌体是由脂肪组织衍生的干细胞（ADSCs）产生的，已被证明在携带治疗性生长因子和微小RNA方面具有潜力，可以加速伤口愈合。然而，在缺氧条件下，外泌体的细胞内递送效率受限，影响其治疗效果。在缺氧组织中，外泌体由于缺氧诱导的内吞回收作用，递送效率降低，显著阻碍治疗效果。因此，需要开发新的方法来提高外泌体在缺氧伤口组织中的递送效率。

在本研究中，伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的Joseph Irudayaraj教授团队提出了一种新的策略，即利用氧纳米气泡和ADSCs外泌体结合的方式，将其嵌入具有自愈和止血特性的PVA/明胶水凝胶中。这种组合不仅可以缓解伤口缺氧，还能有效递送外泌体。该水凝胶具有动态交联的自愈特性和组织粘附能力，通过化学硼酸酯键分解过氧化氢，从而减轻炎症。此外，水凝胶中的明胶成分有助于促进血液凝固，加速创伤和手术伤口的愈合。

（A）通过将EBO纳米颗粒与聚乙烯醇（PVA）和明胶（GA）结合，并使用硼砂作为交联剂，成功制备了一种多功能的EBO-Gel水凝胶。该水凝胶通过化学交联形成稳定的三维网络结构，展示了出色的机械性能和生物相容性。在图中，展示了EBO-Gel的合成步骤，包括EBO纳米颗粒的制备、PVA和GA的混合以及硼砂的交联过程。结果表明，EBO-Gel在伤口愈合中具有显著的潜力，能够提供氧气、递送外泌体，并在体内形成稳定的凝胶网络。（B）EBO-Gel在伤口愈合中的多重功能。首先，EBO-Gel能够通过氧气供应缓解缺氧环境，促进血管生成，改善血液供应。其次，水凝胶中的硼酸酯键能够与过氧化氢（H₂O₂）反应，减轻炎症反应。此外，EBO-Gel的自愈特性和组织粘附能力使其在止血方面表现出色，能够有效控制出血。最后，EBO-Gel还展示了增强外泌体递送的能力，促进细胞迁。

（A）制备了EBO纳米颗粒，首先从脂肪组织中提取脂肪源干细胞（ADSCs）并分离出外泌体，然后将牛血清白蛋白（BSA）与葡聚糖结合形成结合物，再引入氧气纳米气泡（ONB），最终将外泌体与氧气纳米气泡结合形成EBO纳米颗粒。（B）使用纳米颗粒跟踪分析（NTA）技术分析了EBO纳米颗粒的浓度分布，结果显示EBO颗粒的尺寸主要集中在100-300 nm范围内，确保了一致性和均匀性。（C）比较了ONB和EBO纳米颗粒的粒径分布，显示EBO纳米颗粒的粒径略大于ONB，表明外泌体的包覆增加了颗粒的尺寸。（D）测定了各种组分的zeta电位，包括BSA、外泌体（Exo）、EBO纳米颗粒（EBO）、ONB和葡聚糖（Dex），结果显示各组分的zeta电位存在显著差异，EBO颗粒的电位值表明其具有良好的稳定性。（E）通过透射电子显微镜（TEM）观察了EBO纳米颗粒，结果显示EBO颗粒呈现出明显的核-壳结构，验证了外泌体成功包覆在氧气纳米气泡外部。（F）使用共聚焦显微镜观察了EBO纳米颗粒，图（i）显示了绿色荧光标记的EBO颗粒，图（ii）则展示了三维重建的EBO颗粒，进一步验证了其核-壳结构和均匀分布。（G）测定了不同样品在294 nm和420 nm处的紫外-可见吸收光谱，BSA、混合物（Mix）和ONB的吸收峰显示出显著差异，表明各组分之间的结合情况，特别是EBO颗粒在这两个波长处的吸收峰验证了其成功合成。（H）通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析了EBO纳米颗粒，EBO颗粒在3278 cm^-1、1650 cm^-1和1240 cm^-1处的特征吸收峰分别对应于O-H伸缩振动、C=O伸缩振动和C-O-C伸缩振动，表明BSA和ONB的成功结合。（I）进行了SDS-PAGE凝胶电泳分析，不同样品（包括BSA、外泌体、EBO、ONB和葡聚糖）的电泳条带显示了各组分的分子量分布，EBO颗粒的条带进一步证明了其成功合成和稳定性。

（A）将PVA、GA和EBO混合物与硼砂反应生成了EBO-Gel。（B）EBO-Gel可以通过注射器挤出并成型，显示了其良好的成型能力。（C）EBO-Gel可以制成各种形状，展示了其良好的可塑性。（D）EBO-Gel展示了自愈合特性，被切割后能够在不同时间点（1分钟、3分钟、10分钟、30分钟和100分钟）逐渐恢复原状。（E）EBO-Gel经过多次切割和重新组装后，依然能够恢复其储能模量（G'）和损耗模量（G''），展示了其优异的自愈合能力。（F）EBO-Gel展示了其黏附性，能够紧贴于手指表面。（G）EBO-Gel的机械强度测试，显示其能够承受不同程度的拉伸和压缩。（H）流变学分析比较了空白凝胶和EBO-Gel的储能模量（G'）和损耗模量（G''），结果显示EBO-Gel具有更好的机械性能。（I）扫描电子显微镜（SEM）图像显示了空白凝胶和EBO-Gel的微观结构，EBO-Gel表现出更致密的结构。（J）EBO-Gel在大鼠肝脏上的粘附性测试，展示了其在生物组织上的优异粘附性能。（K）EBO-Gel应用于伤口愈合实验，展示了其在实际应用中的潜力和有效性。

（A）制备了EBO-Gel，其功能包括提供氧气、递送外泌体和功能性miRNA、抗炎以及过氧化氢清除。（B）检测了不同凝胶（EBO-Gel、ONB-Gel、Exo-Gel、Blank-Gel）的氧气释放情况，结果显示EBO-Gel具有持续的氧气释放能力。（C）在缺氧条件下，使用不同凝胶处理细胞并通过免疫荧光染色检测缺氧诱导因子HIF-1α的表达，结果显示EBO-Gel显著降低了HIF-1α的表达。（D）通过检测过氧化氢浓度随时间的变化，结果显示EBO-Gel能够有效清除过氧化氢。（E）通过荧光显微镜检测细胞中的活性氧（ROS）和超氧化物歧化酶（SOD）水平，结果显示EBO-Gel处理组ROS水平显著降低，SOD水平显著升高。（F）通过流式细胞术定量分析不同处理组细胞中ROS和SOD的阳性细胞比例，结果显示EBO-Gel显著降低了ROS阳性细胞比例并显著提高了SOD阳性细胞比例。（G）通过流式细胞术分析不同凝胶处理组细胞中ROS的分布，结果显示EBO-Gel处理组的ROS水平最低。

（A）在缺氧、常氧和缺氧加EBO条件下，用免疫荧光染色检测溶酶体相关膜蛋白2（Lamp2）（红色）、CFSE标记的外泌体（绿色）和DAPI染色的细胞核（蓝色），结果显示缺氧条件下Lamp2与外泌体的共定位显著增加，而加入EBO后共定位减少。（B）荧光强度沿细胞距离的变化显示，在缺氧条件下Lamp2和外泌体的荧光强度高度重叠，而常氧和EBO-Gel处理后这种重叠显著减少，下方的曼德斯共定位系数也表明EBO-Gel显著降低了Lamp2与外泌体的共定位。（C）实验流程图展示了外泌体在不同条件下的摄取和回收过程，细胞先处理CFSE标记的外泌体24小时，随后洗去未摄取的外泌体，在不同条件下回收并测量荧光强度。（D）不同条件下外泌体荧光强度随时间的变化显示，EBO-Gel处理显著提高了外泌体的摄取效率，缺氧条件下外泌体摄取最低，常氧条件介于两者之间。

（A）检测了不同凝胶（Exo-Gel、ONB-Gel、EBO-Gel）在不同浓度下对细胞活力的影响，结果显示各组之间细胞活力无显著差异。（B）检测了不同凝胶对红细胞的溶血率，结果显示所有凝胶的溶血率都很低，表明其良好的生物相容性。（C）展示了EBO-Gel的止血机制，包括栓塞止血和活化血小板介导的止血。（D）通过体外凝血实验，比较了EBO-Gel与对照组在红细胞和全血中的止血效果，结果显示EBO-Gel具有显著的凝血性能。（E）在大鼠肝脏出血模型中，比较了EBO-Gel与对照组的止血效果，结果显示EBO-Gel能够有效止血。（F）通过测量失血量，定量评估了EBO-Gel的止血效果，结果显示EBO-Gel处理组的失血量显著低于对照组。

（A）用免疫荧光染色法检测了不同凝胶处理后细胞增殖情况，DAPI染色（蓝色）显示细胞核，BrdU染色（绿色）显示新合成的DNA，结果显示EBO-Gel组细胞增殖显著增加。（B）通过MTT法测定不同凝胶处理后细胞的增殖情况，结果显示EBO-Gel组在24小时和48小时的细胞增殖显著高于其他组。（C）用免疫荧光染色法检测了不同凝胶处理后细胞活性氧（ROS）水平，结果显示EBO-Gel组细胞ROS水平显著降低。（D）通过划痕实验评估不同凝胶处理后的细胞迁移能力，结果显示EBO-Gel组在12小时和24小时的伤口愈合率显著高于其他组。（E）定量分析了不同凝胶处理后的伤口愈合率，结果显示EBO-Gel组的愈合率最高。（F）用Transwell实验评估了不同凝胶处理后细胞的迁移能力，结果显示EBO-Gel组迁移细胞数量最多。（G）定量分析了不同凝胶处理后迁移细胞的数量，结果显示EBO-Gel组迁移细胞显著增加。（H）用管形成实验评估了不同凝胶处理后内皮细胞的成管能力，结果显示EBO-Gel组成管结构最明显。（I）定量分析了不同凝胶处理后成管结构的分支数量，结果显示EBO-Gel组的分支数量最多。（J）定量分析了不同凝胶处理后成管结构的总长度，结果显示EBO-Gel组的总长度最长。（K）用流式细胞术分析了不同凝胶处理后细胞周期分布，结果显示EBO-Gel组在G2/M期的细胞比例最高，表明其促进了细胞的增殖和分裂

（A）展示了实验的治疗时间线，从第0天进行伤口处理和敷料更换，直到第14天收集组织样本。（B）展示了不同处理组（Tegaderm、Blank-Gel、Exo-Gel、ONB-Gel、EBO-Gel）在第0、2、4、6、8、10和14天的伤口愈合情况，结果显示EBO-Gel组的伤口愈合速度最快。（C）通过颜色编码图展示了不同处理组在第0、2、4、6、10和14天的伤口面积变化。（D）用热图展示了不同处理组在各时间点的伤口面积，EBO-Gel组的伤口面积显著减少。（E）定量分析了不同处理组在各时间点的伤口愈合率，结果显示EBO-Gel组的伤口愈合率显著高于其他组。（F）展示了各处理组小鼠在实验期间的相对体重变化，结果显示各组小鼠的体重变化无显著差异。

（A）通过苏木精-伊红（H&E）染色观察了不同处理组（Tegaderm、Blank-Gel、Exo-Gel、ONB-Gel、EBO-Gel）在伤口愈合过程中皮肤组织的形态变化，结果显示EBO-Gel组的组织结构更接近正常皮肤，炎症细胞浸润较少。（B）通过Masson三色染色评估了不同处理组在伤口愈合过程中胶原纤维的形成情况，结果显示EBO-Gel组的胶原纤维排列更加紧密，表明其促进了伤口的重建。（C）定量分析了不同处理组的瘢痕指数，结果显示EBO-Gel组的瘢痕指数显著低于其他组，表明其减少了瘢痕形成。（D）定量分析了不同处理组的真皮厚度，结果显示EBO-Gel组的真皮厚度显著增加，表明其促进了皮肤组织的重建。（E）通过免疫荧光染色检测了不同处理组中CD31（血管内皮细胞标志物）的表达，结果显示EBO-Gel组的血管生成能力最强。（F）定量分析了不同处理组的胶原体积分数，结果显示EBO-Gel组的胶原体积分数最高，表明其促进了胶原合成。（G）通过免疫荧光染色检测了不同处理组中CD86和F4/80（炎症标志物）的表达，结果显示EBO-Gel组的炎症水平最低，表明其具有良好的抗炎效果。（H）定量分析了不同处理组的表皮厚度，结果显示EBO-Gel组的表皮厚度显著增加，表明其促进了表皮的再生。（I）通过免疫荧光染色检测了不同处理组中CD31（血管内皮细胞标志物）的表达，结果显示EBO-Gel组的血管生成能力最强。

综上所述，这项研究中开发的EBO-Gel展示了其在伤口愈合中的显著潜力。EBO-Gel不仅展示了优异的物理和生物性能，包括自愈合能力、良好的机械强度、黏附性和生物相容性，而且在体外和体内实验中均表现出优越的抗炎、促血管生成和组织再生的能力。在体外实验中，EBO-Gel显著降低了细胞中的活性氧（ROS）水平，促进了细胞增殖、迁移和成管能力；在体内实验中，EBO-Gel有效促进了大鼠皮肤伤口的愈合，减少了瘢痕形成，增加了真皮厚度和表皮再生。与其他处理组相比，EBO-Gel处理组在多个关键指标上均表现出更好的治疗效果。这些结果表明，EBO-Gel在未来的临床应用中具有巨大的潜力，可以为伤口愈合提供一种有效的新型治疗方案。

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