药物遗传毒性评价研究关注点

药物; 遗传毒性; 体内; 体外; 非临床研究质量管理规范

遗传毒性试验可分为体外和体内试验两大类[1-2]。体外试验主要包括: ①细菌回复突变试验。②体外哺乳类细胞染色体畸变试验。③体外哺乳动物细胞微核试验。④体外小鼠淋巴瘤细胞胸苷激酶(thymidine kinase，Tk)基因突变试验。⑤荧光原位杂交(FISH)。体内试验主要包括: ⑥体内微核试验。⑦体内中期相细胞染色体畸变试验。⑧体内彗星试验。⑨体内碱洗脱试验。⑩转基因小鼠体内突变试验。

遗传毒性试验无论是组合一还是组合二，细菌回复突变试验和体内动物试验是必选试验，如果采用组合一进行评价，还会涉及体外细胞试验，因此从事遗传毒性试验的人员应接受过与其工作相关的专业和技能培训，具备所承担工作需要的知识、经验和能力。例如: 从事细胞、细菌体外试验的人员应具有微生物学、细胞生物学等学科知识，并经过专业化培训，熟练掌握细菌、细胞的复苏、培养、传代、冻存等技术，配制给药制剂的人员在配制过程中也应无菌操作; 从事体内动物试验的人员，则应先接受动物专业知识的理论培训，上岗前动物称重、给药、临床观察、安乐死等操作也必须经过培训和考核; 对于阅片人员，如显微镜下分析染色体结构畸变的类型、计数未成熟红细胞及微核，还必须经过更长时间的培训，考核合格后方可进行相关操作。此外，人员应定期体检并评估体检结果，确保身体状况不能影响研究工作[8]。

开展遗传毒性试验，要具备细胞实验室、细菌实验室、屏障环境动物房等设施。细胞实验室、细菌实验室应定期检测空气洁净度及沉降菌，测试要求可参考GB50591-2010《洁净室施工及验收规范》、GB/T16292-2010《医药工业洁净室(区)悬浮粒子的测试方法》、GB/T16294-2010《医药工业洁净室(区)沉降菌的测试方法》[9-11]等。动物饲养环境指标如温度、湿度、压差、噪声、照度、洁净度、沉降菌等应符合GB14925-2023《实验动物环境及设施》[12]要求。此外，传递物品时会用到传递窗紫外线灯对物品进行消毒，需对紫外线灯的消毒效果进行验证并定期检测紫外线灯的辐照强度。

4.1 仪器设备

遗传毒性试验实施过程中用到的仪器种类繁多，如各种温度范围的冰箱、高压灭菌器、生化培养箱、二氧化碳培养箱、水浴锅、生物安全柜、电子天平、移液器、离心机、液氮罐、pH计、搅拌器、显微镜等，每台/套仪器均要有明确的仪器责任人，放置地点合理且有状态标识，并定期进行清洁、维护保养与校准、确认或验证。为方便管理，最好建立一个清晰的仪器台账，用于记录各个仪器的名称、型号、生产厂商、启用日期、责任人、放置位置、本次及下次计量检定/校准、验证日期等。其中，试验中必不可缺的仪器设备是高压灭菌器，工作压力≥0.1MPa、容积≥30L压力容器的操作人员必须取得特种设备作业人员资格证后方可进行操作[13-14]，试验中所用的超净工作台应定期对沉降菌、气流流速、洁净度等进行检测[15-16]，生物安全柜应定期检测下降气流流速、流入气流流速等[17]。液氮罐需定期检测液氮量，储存培养基的冰箱和培养细菌、细胞的培养箱则应监测温度，如果试验实施过程中温度波动超过允许范围，应及时向专题负责人汇报，并评估对试验的影响。此外，如果试验中使用了菌落计数仪、细胞计数仪、细胞流式仪等，此类仪器还应定期进行性能验证，确保性能符合要求。全自动菌落计数仪、细胞流式仪等计算机化系统管理应符合GLP要求，如需对用户登录、权限分配进行管理，确保登录用户的唯一性，系统应开启稽查轨迹功能，生成的电子数据要定期备份，系统发生变更时需进行评估以确认是否需要进行验证，系统退役时要有对原系统数据查阅与追溯的措施等[8，18]。

4.2 实验材料

遗传毒性试验周期虽短，试验涉及试剂却种类繁多，Ames试验需要琼脂粉、牛肉膏、葡萄糖、L-组氨酸、D-生物素等试剂20余种[19-23]，体外细胞染色体畸变试验需要细胞培养基、血清、秋水仙素、甲醇、乙酸等试剂也约20种[24-27]，几乎都需要由不同成分试剂的组合才能配成最终所要的试剂，如Ames试验中菌株鉴定用的组氨酸-生物素平板，是由琼脂培养基、磷酸盐贮备液/Vogel-Bonner(V-B)培养基E、葡萄糖、组氨酸、生物素等溶液按照比例组合而成，需要使用的试剂高达9种。而且，不同试剂的储存条件和有效期也不尽相同，因此实验室试剂的管理至关重要，应做好台账，定期清点储存量和有效期，变质或过期的试剂及时处置。

遗传毒性试验耗材主要有枪头、平皿、锥形瓶、离心管、玻片、烧杯、量筒等，且耗材中许多为遗传试验专用，如冻存管、细胞培养瓶等，因此要定期清点库存，及时补充。

5.1 受试物、溶剂对照品

受试物和溶剂对照品应有专人保管，其接收、登记、分发手续齐全并完整记录。对于给药时间超过4周的试验，委托方提供的受试物和溶剂对照品应留样归档，若为常规市售溶剂，如氯化钠注射液、灭菌注射用水、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)等，可根据机构制定的标准操作规程(standard operating procedure，SOP)中的要求确定是否需要留样。因遗传毒性体外试验有其特殊性，给药制剂配制时，溶剂一般首选水或DMSO，需注意的是，染毒过程中添加DMSO的量不宜过多，指导原则中未对其进行具体规定，可参考其他标准，如食品安全国家标准GB15193.4-2014《细菌回复突变试验》中规定Ames试验每平板DMSO原液的添加量不超过0.1mL[20]，GB15193.23-2014《体外哺乳动物细胞染色体畸变试验》中规定体外染色体畸变试验DMSO浓度不应大于0.5%[25]，OECD TG473则规定一般不超过1%(v/v)[28]，其目的都是保证DMSO不对实验系统产生毒性。除了上述水或DMSO以外的溶剂，均不应与受试物发生反应，且对菌株、细胞和哺乳动物肝脏微粒体酶(S9)没有毒性和诱变性。配制后的给药制剂不应对实验系统造成污染，必要时可采取适当方法灭菌或除菌。DMSO为溶剂时，因DMSO有抑菌作用[29-30]，受试物与细胞、细菌接触作用时一般情况下不会导致污染，建议通过预试验确定是否有污染发生。

5.2 阳性对照品和麻精药品

遗传毒性试验常会用到致突变剂，如环磷酰胺、丝裂霉素等，这些物质已明确能致突变，建议在保存过程中实行双人双锁管理，双人发放和领用，做到账物相符。配制和使用过程中应穿戴好个人防护用品，如一次性无菌衣、手套、口罩、防护镜等; 称量阳性对照品的电子天平最好能做到专用，并要贴有醒目标识。使用完毕后，可按照食品安全国家标准或参考文献，利用化学反应破坏这些物质中引起致突变作用的官能团，达到无害化处理[31-32]。此外，体内试验动物实施安乐死时，会用到异氟烷、舒泰^Ⓡ50等兽用麻醉剂，应严格管理防控风险，其储存和使用建议参考麻精药品管理方法，使用完毕后可倒入脱脂棉等可吸收材料吸附暂存或大量稀释后倒入废液桶中，交由有资质的专业公司处理。

6.1 细菌

Ames试验中，菌株为组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门菌和/或色氨酸营养缺陷型大肠埃希菌，至少应包含以下5种菌株的组合: TA98，TA100，TA1535; TA1537或TA97或TA97a，TA102或大肠埃希菌WP2uvrA或大肠埃希菌WP2uvrA(pKM101)。所用菌株应背景资料清楚，定期进行菌株鉴定，包括组氨酸/色氨酸缺陷型的鉴定、脂多糖屏障缺陷的鉴定(结晶紫敏感)、R因子的鉴定(抗氨苄青霉素)、四环素抗性的鉴定、uvrB修复缺陷型的鉴定(紫外线敏感)等，鉴定合格后可批量冻存备用。国内药物Ames试验使用较多的组合是TA97/TA97a，TA98，TA100，TA102，TA1535[33-39]，这些菌株生长均需组氨酸，均对结晶紫敏感，除TA1535外均具有氨苄青霉素抗性，除TA102外均对紫外线敏感并均无四环素抗性。

6.2 细胞

体外哺乳类细胞染色体畸变试验，因中国仓鼠肺细胞(Chinese Hamster Lung Cells，CHL)对诱变剂敏感，易在体外建立细胞系，染色体数目较少且核型稳定，便于染色体分析，因此使用频率较多[40-42]。Tk基因突变试验通常采用L5178Y Tk^+/--3.7.2C小鼠淋巴瘤细胞。使用前，应对细胞支原体污染、核型等进行检查。

培养时，先肉眼观察培养液的颜色以及是否澄清，然后在倒置显微镜下观察细胞的生长状态、有无污染，常见为细菌、霉菌和支原体污染，导致细胞生长缓慢或停止增殖直至死亡。其中细菌污染最易被发现，培养液短时间内会变浑浊，支原体污染则在培养初期不易被发现，可用荧光染色方法进行支原体检查，荧光显微镜下观察可见在细胞核外与细胞表面的荧光小点或丝状点为支原体污染，也可用PCR检测、支原体培养等方法检测支原体[43-44]。可通过检查细胞分裂中期的染色体进行核型分析，Lorge等[41]报道CHL细胞模态染色体数目为25条，L5178Y Tk^+/--3.7.2C细胞模态染色体数目为40条。

6.3 大鼠/小鼠

体内动物试验常用动物为大鼠和小鼠，动物抵达后应进行环境适应，个体标识清晰，群体饲养并提供适当的环境丰富物品，如磨牙棒、筑巢材料等[45-46]。动物的使用应关注动物福利，试验方案实施前应获得动物伦理委员会批准。

动物饲料、垫料应由合格供应商供应，并定期检测，检测频率可由机构根据实际情况制定。饲料的质量检测包含常规营养成分指标、化学污染物指标、微生物指标; 垫料检测包括物理性指标、污染物指标、微生物指标; 饮用水检测包括感官性状、一般化学指标、微生物指标、毒理指标。饲料、垫料、饮用水的检测报告应进行评估，饲料评估标准可参照国家标准GB14924.3-2010《实验动物配合饲料营养成分》、GB/T14924.2-2001《实验动物配合饲料卫生标准》、GB/T18823-2010《饲料检测结果判定的允许误差》[47-49]，垫料评估标准可参照北京市地方标准DB11/T1126-2014《实验动物垫料》、国家标准GB14925-2023《实验动物环境及设施》等[12，50]，饮用水评估标准可参照国家标准GB5749-2022《生活饮用水卫生标准》、GB14925-2023《实验动物环境及设施》的要求[12，51]。

目前药物遗传毒性评价试验方法多采用细菌回复突变试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验、哺乳动物体内微核试验的标准组合[33-39]。专题负责人要全面负责研究项目的实施和质量，研究相关的资料，如试验方案、原始数据、标本、受试物和对照品留样(如有)、总结报告以及与研究有关的其他文件、电子资料等，应及时归档且归档资料内容要完整。

7.1 细菌回复突变试验

试验实施过程中，应着重检查菌株的接收、复苏、传代、冻存、鉴定，试剂配制、受试物配制、分析以及与细菌受试物作用、培养、菌落观察计数等。

需要注意的是，指导原则中未明确要求与受试物作用前细菌的数量，OECD TG471以及化学品、食品、农药、化妆品国家标准及规范中均要求加药前细菌数达到109个·mL^-1[19-22，52]，因此，每个实验室均应建立本实验室的菌株复苏、培养、冻存等相关SOP，以确认培养基、培养温度、培养时间等因素对细菌生长的影响。加药时，受试物至少有5个剂量组，此外还有溶剂对照组和阳性对照组，这就需要底层和顶层培养基各210个，共需加样525次，特殊情况下，还需设立更多的受试物剂量组和空白对照组，所以每个底层平皿均应有唯一的编号且标识清楚、准确，加样过程要注意力集中，将菌液和受试物加入到顶层培养基试管中混匀后迅速倒入底层培养基平板上，倒入后要快速转动平皿使之均匀分布，防止环境温度低时，顶层在均匀分布前过早凝固。此外，还要注意整个加样过程的无菌操作，防止污染。当试验结果为阳性时，回复突变菌落数能达到数千，菌落通常密集难以每个计数，实验室应建立此种情况计数方法的SOP。

7.2 体外哺乳类细胞染色体畸变试验

试验实施过程中，应着重检查细胞株的接收、复苏、传代、冻存、核型检查、支原体污染检查记录; 试剂配制、受试物配制、分析以及细胞与受试物作用、培养、细胞计数、染色体标本制备、染色与镜检等。

细胞染色体畸变试验，从细胞复苏、传代、细胞毒性检测到与受试物作用、收获细胞，细胞要持续培养，因此污染的控制至关重要。制备染色体玻片是整个试验的关键，收获细胞后，需要进行离心、低渗、固定、滴片、染色等过程，每一步操作都要认真仔细、按要求操作，才能制备质量较好的玻片。最常见的影响镜检的因素是染色体的分散程度和染色，可从以下方面进行把控[53-54]: ①秋水仙素的剂量和作用时间。②低渗时间，时间过久则染色体破裂，过短则染色体不能分散。③固定，固定液应新鲜配制，先加少量固定液预固定，防止直接大量加入时凝结成块。④滴片，所用玻片应干净无油污，滴片前可用冰水浸泡，使得细胞悬液容易分散; 滴片时玻片倾斜放置，将细胞悬液滴在玻片不同位置以2滴为宜，轻吹使之扩散; 滴片高度要适中，太高染色体分散，太低则分散不好。⑤染色，磷酸盐缓冲液的pH值应把握好，pH值过高染色体易染成蓝色，影响阅片的舒适感，且染液最好用全新染液，避免重复利用使着色不好。此外，离心的速度与时间、混匀过程的力度、染色后浮色的冲洗等都会影响制片的质量。

7.3 哺乳动物体内微核试验

试验实施过程中，应着重检查动物使用申请、接收、检疫、饲养管理，试剂配制、受试物配制、分析以及动物分组、称重、给药、临床观察、安乐死、骨髓涂片制备、染色与镜检等。

动物给药体积和速度可参考“A Good Practice Guide to the Administration of Substances and Removal of Blood，Including Routes and Volumes”[55]，最大可能地保障实验动物的福利。微核试验中，常采用的是制备胸骨骨髓涂片，动物安乐死后[56]，按常规血涂片法涂片，长度约2~3cm，在空气中晾干[57]，建议即使制备当日不染色，也将玻片标本置固定液中固定后保存[58]。使用吉姆萨染液染色时，嗜多染红细胞呈灰蓝色，成熟红细胞呈粉红色/淡橘红色[59-60]，染色过程中需要调好染色液的pH值，否则不易区分嗜多染红细胞和正染红细胞。除人工镜检方法外，在方法学被充分验证后，也可采用流式细胞术检测外周血微核或采用其他自动化分析系统对微核进行检测。

QA对遗传毒性试验项目进行检查，应制定每项研究项目的检查计划，检查范围要覆盖项目的关键阶段，检查结果均应报告给机构负责人、专题负责人，对检查发现问题要跟踪检查并核实整改结果。对原始数据和总结报告的审查，要审查试验实施与试验方案规定的一致性、总结报告信息与原始记录的一致性以及总结报告是否包括所有偏离SOP和试验方案的情况等，审查总结报告后，QA出具质量保证声明，总结报告批准后如果有修改或补充，QA应重新审查并签署质量保证声明[61]。质量保证部门的检查记录及报告不属于研究档案，在SOP中应明确规定定期归档的具体时限及负责人员。

遗传毒性试验是采用细菌、哺乳动物细胞等测试受试物是否引起基因突变、染色体畸变、DNA损伤的试验，这些试验也包括整体动物试验。检测的遗传终点分为基因突变、染色体畸变、DNA损伤，因遗传终点的多样化，通常不可能在单个实验系统中检测出多个终点，所以常用的科学方式是采用一组试验。

《药物遗传毒性研究技术指导原则》是进行药物遗传毒性试验的基本原则，作为一个指导性文件，目的是为试验组合和结果分析提供指导，未对试验方法的具体操作细节进行详细规定。在试验设计上，应根据受试物特点，遵循“具体问题具体分析”原则，合理选择试验方法及设计试验方案。2种组合中，标准组合一历史应用经验较多[2]，目前药物评价采用较多的是组合一中的Ames试验、体外染色体畸变试验、体内微核试验3种试验组合，根据指导原则要求，体外试验要根据受试物的溶解度和/或对实验系统的毒性来确定高剂量组，且需要加入外源性代谢活化系统模拟体内代谢条件，在加和不加代谢活化系统的条件下进行，如果受试物有毒性作用，微核试验高剂量组要有一定的毒性症状。各实验室应建立菌株回变菌落数、染色体畸变率、微核率的历史背景对照数据库，以有助于确定统计学结果的生物学意义。

药物遗传毒性研究是药物非临床安全性评价的重要组成部分，必须执行《药物非临床研究质量管理规范》。近年来，在药物GLP认证检查中，也发现了遗传毒性试验相关的不符合GLP要求的问题，如原始记录内容不完整、未规定配制后溶液的有效期、总结报告中信息错误等，这就要求试验人员严格执行试验方案和SOP，记录试验产生的所有数据，试验中不能使用变质或过期的溶液，总结报告要真实反映原始数据，报告中各项信息应与原始记录一致。此外，试验中如果使用了机械计数器，其所产生的计数结果是用来计算微核率及染色体畸变率，虽然此仪器功能简单，建议也需定期对此计数器计数的准确性进行确认。Ames试验的试验菌株的某些特性易丢失或变异，建议实验室在SOP中确定长期保存的菌株定期鉴定的频率。动物试验中，机构应对饲料开封后的使用有效期进行验证，对饲料、垫料和动物饮用水的检测报告进行审核。总之，遗传毒性试验在试验人员的资质、实验系统、试验实施的关键阶段等有其特殊性，试验实施应遵从“随机、对照、重复”的基本原则，客观评价受试物潜在的遗传毒性，降低临床用药风险。相信随着我国药物研发水平及GLP认证的高质量发展，遗传毒性试验在实施细节方面也将不断完善。