黄豆酱是我国著名传统发酵调味品之一，主要由米曲霉制成的黄豆曲与一定比例盐水均匀混合后长期发酵制得，具有酱香醇厚、酯香浓郁、咸甜适中的特点。黄豆酱的发酵过程主要由制曲过程中微生物主导，其中以米曲霉为主，微生物通过代谢产生的多种酶系在一系列生化作用下生成多种挥发性风味物质。混菌强化发酵是改善黄豆酱风味品质的有效方法，其可丰富发酵微生物的种类，产生更多酶系分解原料，进一步促进风味物质的形成。红曲霉具有较强的糖化力和酯化力，而米曲霉相应能力较弱，红曲霉制曲后混合发酵丰富了体系中微生物和酶系种类，不仅利于原料的分解利用，还能够加快发酵速率，有助于提升产品的色泽、香气和口感。
四川省食品发酵工业研究设计院有限公司的蒋四强、陈功、邓维琴*等人通过改变黄豆酱发酵所用黄豆曲种类，利用红曲霉制成黄豆曲与米曲霉黄豆曲进行混合强化发酵，探究红曲霉强化发酵对黄豆酱挥发性风味物质以及菌群结构的影响，以期为黄豆酱品质优化提供理论支撑和方法指导。
由图1可知，单菌制曲发酵及混合强化发酵黄豆酱中挥发性风味物质组成和含量有明显差异，黄豆酱A、B、C、D、E中挥发性风味物质含量分别为32.87、8.67、13.39、17.89、14.00 μg/g。米曲霉单菌制曲发酵黄豆酱B挥发性风味物质含量均低于其他4 种黄豆酱。
米曲霉单菌制曲发酵黄豆酱B的酯香较其他黄豆酱更浓郁，但其他风味化合物含量较低，风味特征不明显。通过使用红曲霉强化发酵，黄豆酱中芳香烃、醇类、醛酮类以及酸类物质含量较米曲霉单菌制曲发酵（黄豆酱B）得到显著提升。其中红曲霉单菌制曲发酵黄豆酱A和混合强化发酵黄豆酱C、D、E含有较高的醇类、醛酮类和酸类物质，但混合强化发酵黄豆酱C较其他强化发酵黄豆酱的酸类和酯类物质含量更高，因此，混合强化发酵黄豆酱C可能风味更协调，具有较好的风味品质。
为了进一步了解红曲霉强化发酵对黄豆酱挥发性风味物质的影响，对39 种主要呈香风味化合物进行PCA，如图2A所示。PC1和PC2累计贡献率达到84.6%，可代表大部分风味物质的信息。黄豆酱A、B、C、D、E分布在4 个不同象限，说明5 种黄豆酱中风味化合物存在较大差异。结合图2B可知，异戊醇、正己醇、1-辛烯-3-醇、芳樟醇、2,3-丁二醇、苯乙醇、2-乙基己醇、2-壬醇、苯酚、壬醛、桧烯等与PC1具有较高的正相关性，是红曲霉单菌制曲发酵黄豆酱A中主要差异化合物；糠醇、3-甲硫基丙醇、2-甲基苯酚、辛醇以及2-辛烯-1-醇与PC1具有较高的负相关性，是混合强化发酵黄豆酱C中的主要差异化合物；而反-2-辛烯醛、1-辛烯-3-酮、2-己酮和麦芽醇、苯甲酸甲酯异戊醛等分别为米曲霉单菌制曲发酵黄豆酱B和混合强化发酵黄豆酱D中的主要差异化合物。强化发酵黄豆酱E中的差异化合物主要为4-壬酮、2-壬酮。
如表4所示，所有黄豆酱样本中覆盖率均在0.999以上，表明在此测序深度下所得的基因序列可基本覆盖样本中所有的微生物物种，所得数据可较为真实地反映样本中微生物群落的组成情况。各发酵阶段不同黄豆酱中细菌Chao1和Shannon指数均大于真菌，说明黄豆酱中细菌群落的丰富度和多样性远高于真菌群落。但不同黄豆酱在发酵过程中细菌群落的丰富度和多样性有明显区别，米曲霉单菌制曲发酵黄豆酱B的Chao1指数高于其他黄豆酱，但Shannon指数低于红曲霉单菌制曲发酵黄豆酱A及混合强化发酵的黄豆酱，其中混合强化发酵黄豆酱C和D的Shannon指数最高，分别为2.783 61和3.005 41。说明米曲霉发酵黄豆酱在细菌丰富度上存在优势，但多样性不及强化发酵的黄豆酱。米曲霉单菌制曲发酵黄豆酱B真菌丰富度高于强化发酵黄豆酱，而明显低于强化发酵黄豆酱，其中混合强化发酵黄豆酱C中真菌Shannon指数达到1.153 44，高于米曲霉单菌制曲发酵黄豆酱B（1.052 64）。
由此可见，相比于米曲霉制曲发酵，红曲霉强化发酵黄豆酱在细菌和真菌多样性方面具有较为明显的优势。Mao Jingjing等研究表明，发酵过程中细菌和真菌群落与多种风味化合物之间存在着极显著的正相关关系，强化发酵黄豆酱中相对较高的细菌和真菌多样性可能会对丰富黄豆酱风味物质组成发挥一定的积极作用，这可能是导致米曲霉单菌制曲发酵黄豆酱B风味物质含量和种类不及强化发酵黄豆酱的原因之一，同时也说明红曲霉对黄豆酱的菌群结构有一定的影响。
黄豆酱发酵过程中门水平细菌群落结构组成如图3A所示。厚壁菌门（Firmicutes）为黄豆酱发酵过程中绝对的优势菌门，其相对丰度在95.33%以上。在属水平上，不同黄豆酱中细菌组成相似，芽孢杆菌属（Bacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）和明串珠菌属（Leuconostoc）是主要优势菌属，但在不同黄豆酱中菌群的相对丰度存在较大差异（图3B）。在发酵初期，Bacillus是黄豆酱B发酵过程中的绝对优势菌属，其相对丰度在71.25%以上。Bacillus也是红曲霉单菌制曲发酵黄豆酱A和混合强化发酵黄豆酱C、D、E发酵前期的优势菌属；但随着发酵的进行，Staphylococcus相对丰度逐渐上升，在发酵中后期成为优势菌属，在发酵40 d的红曲霉单菌制曲发酵黄豆酱A中其相对丰度达到93.08%。在传统豆酱和酱渣中，Staphylococcus也是发酵后期的优势细菌属。有研究发现，Staphylococcus可以有效促进氨基酸代谢类风味物质的产生，同时可以降低脂质氧化类的形成速率。红曲霉单菌发酵黄豆酱A和混合强化发酵黄豆酱C、D、E中存在较低相对丰度的Leuconostoc（0.90%～8.65%），且贯穿整个发酵过程。Wang Dahong等发现Leuconostoc在豆制品发酵中有利于酯类、酮类以及酸类等风味化合物的生成，对提升黄豆酱的风味品质有一定作用。但随着Staphylococcus相对丰度的上升，Leuconostoc相对丰度逐渐下降，推测两者之间可能存在竞争关系。由此可见，用红曲霉制曲强化发酵对黄豆酱中的细菌多样性及相对丰度有一定的影响，从而影响黄豆酱的品质。
由图4可知，子囊菌门（Asomycota）为绝对的优势真菌菌门，相对丰度在99.78%以上。在属水平上，不同黄豆酱中真菌组成相似，但相对丰度差异较大（图4B）。红曲属（Monascus）、米勒酵母属（Millerozyma）和曲霉属（Aspergillus）是主要优势菌属，其中Monascus出现在红曲霉单菌制曲发酵黄豆酱A和混合强化发酵黄豆酱的发酵前期，Monascus在红曲霉单菌制曲发酵黄豆酱A中相对丰度达到99.71%，在混合强化发酵黄豆酱C、D、E中其相对丰度分别为28.37%、48.58%和70.30%。发酵第2天，Monascus相对丰度开始下降，说明Monascus主要在发酵前期起作用。Monascus属于好氧菌，对盐不耐受，黄豆酱在含有12%盐分的密闭条件下进行发酵，受氧气含量和盐的影响，Monascus的生长代谢减缓，导致相对丰度在发酵前期开始下降。Millerozyma在红曲霉单菌制曲发酵黄豆酱A发酵2 d开始出现，到了发酵后期，Millerozyma取代Monascus成为优势菌属，相对丰度为99.86%，混合强化发酵黄豆酱C、D、E中其相对丰度分别为41.40%、50.22%和39.78%。同时，Millerozyma对黄豆酱发酵过程中挥发性风味物质的形成具有积极作用，其相对丰度不同可能是导致不同黄豆酱中醇类物质含量差异较大的主要原因之一。Millerozyma属于兼性厌氧菌，能很好地适应发酵罐中的缺氧条件，且有研究发现，Millerozyma在含盐量为11%～14%的豆瓣酱中也是优势菌属，说明Millerozyma具有一定的耐盐性，这可能是Millerozyma在发酵中后期成为优势菌属的主要原因。Aspergillus是米曲霉单菌制曲发酵黄豆酱B和混合强化发酵黄豆酱C、D、E中的优势菌属之一，在发酵后期其相对丰度分别为53.21%、58.48%、49.74%和60.13%。研究表明，Aspergillus和Millerozyma共存时有利于风味物质的形成。
为了进一步了解黄豆酱发酵过程中微生物与挥发性风味物质之间的关系，通过对优势微生物和挥发性风味物质数据进行同理化处理和相关性分析，结果如图5所示。Aspergillus和Bacillus是米曲霉单菌制曲发酵黄豆酱B中的主要优势菌属，其中Bacillus与大多数醇类和酚类物质呈显著负相关（0.85＜|r|＜0.96），而与辛酸辛酯、γ-硬脂酸内酯具有较强的正相关性（0.56＜r＜0.84），研究证明，在酱类食品的发酵过程中，Bacillus的代谢是影响豆酱发酵后期挥发性酯类含量的重要因素。而Bacillus在米曲霉单菌制曲发酵黄豆酱B的发酵过程中相对丰度较高，这可能是导致其酯类化合物含量高于其他黄豆酱的原因。Aspergillus与4-甲基-2-庚酮、2-甲基-3-己酮和反-2-辛烯醛呈显著或极显著正相关（0.86＜|r|＜0.97）。Staphylococcus、Leuconostoc和Monascus是混合强化发酵组与米曲霉单菌制曲发酵黄豆酱B的主要差异微生物，其中Staphylococcus与黄豆酱中1-辛烯-3-醇、2,7-二甲基-4,5-辛二醇、邻苯二甲醚、3-羟基-2-丁酮及1-甲氧基-4-[(Z)-1-丙烯基]苯呈显著或极显著正相关（r＞0.90）。Leuconostoc与4-甲基-2-戊酮呈显著正相关（r＞0.90），4-甲基-2-戊酮具有相对较低的风味阈值和较为突出的草木味和果香味。Monascus则与1-辛烯-3-醇、(2R,3R)-2,3-丁二醇、芳樟醇、苯乙醇、愈创木酚、3-羟基-2-丁酮、邻苯二甲醚、2,7-二甲基-4,5-辛二醇、1-甲氧基-4-[(Z)-1-丙烯基]苯等物质呈显著或极显著正相关（r＞0.85），其在红曲霉发酵的米酒中也有相似发现，具有青草味、花香味、玫瑰味、草木香等气味，这表明Monascus对黄豆酱中花草香气的形成具有贡献作用。由此可以看出，由差异微生物代谢产生的化合物对黄豆酱整体风味具有较大的作用，而这些化合物可能是区别于米曲霉单菌制曲发酵黄豆酱B风味的关键风味物质。Millerozyma主要与异戊醇呈显著正相关（r＝0.92），与第5节分析结果一致，虽然Millerozyma在米曲霉单菌制曲发酵黄豆酱B发酵后期具有较高的相对丰度，但在发酵过程中产生以异戊醇为主的醇类化合物较少，因此，混合强化发酵的黄豆酱和米曲霉单菌制曲发酵的黄豆酱B在醇类风味上有较大的区别。Faecalibaculum则主要与1-辛烯-3-醇、(2R,3R)-2,3-丁二醇、芳樟醇、苯乙醇、愈创木酚、邻苯二甲醚等物质呈显著负相关（0.85＜|r|＜0.95），说明Bacillus和Faecalibaculum不利于黄豆酱中花草香气的形成。
本研究将米曲霉和红曲霉分别制成黄豆曲，以米曲霉单菌制曲发酵黄豆酱作为对照，将两种黄豆曲混合进行强化发酵黄豆酱，研究红曲霉强化发酵对黄豆酱风味化合物以及菌群结构的影响。结果表明，红曲霉单菌制曲发酵黄豆酱和混合强化发酵的黄豆酱中醇类、芳香类、醛酮类以及酸类挥发性风味物质含量远高于米曲霉单菌制曲发酵的黄豆酱。混合强化发酵黄豆酱微生物多样性远高于米曲霉单菌制曲发酵的黄豆酱。混合强化发酵黄豆酱中Monascus、Millerozyma、Staphylococcus和Leuconostoc相对丰度显著高于米曲霉单菌制曲发酵的黄豆酱，且这些差异微生物与醇类、芳香类、醛酮类风味物质具有较强的正相关性。综上所述，红曲霉混合强化发酵通过影响菌群结构进一步影响风味化合物的形成，使风味化合物的种类及含量相较于米曲霉单菌制曲发酵黄豆酱更加丰富，其中米曲霉黄豆曲和红曲霉黄豆曲按照3∶1质量比混合强化发酵黄豆酱风味更协调，具有更好的风味品质。因此，在黄豆酱的实际生产中，可以通过加入红曲霉强化发酵提升黄豆酱的风味品质，达到改善黄豆酱品质的目的。
本文《红曲霉强化发酵对黄豆酱风味物质及菌群结构的影响》来源于《食品科学》2023年45卷第9期93-101页，作者：蒋四强，陈功，李雄波，王泽亮，范智义，李婷，李恒，张其圣，邓维琴*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230531-288。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
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