研究成果| 北方民族大学魏兆军教授:纳豆代谢变化和异黄酮生物转化改善营养分配和生物利用度

美食   2024-12-03 07:01   上海  


Abstract
采用LC-MS对枯草芽孢杆菌DC-15发酵大豆的代谢变化进行了分析,了解大豆的生化变化。总共观察到650种不同的代谢物,其中氨基酸、二肽、脂肪酸、小分子糖和异黄酮的丰度最大。京都基因与基因组百科(KEGG)分析显示,大豆发酵过程中的主要代谢途径与氨基酸代谢有关,包括β-丙氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢。在胃期,大豆异黄酮成功地从糖苷形式(50.04 μg/mL)转化为苷元形式(104.07 μg/mL)。在纳豆消化的各个阶段,蛋白质和脂质颗粒的分布呈现出由聚集颗粒向更分散颗粒的变化。对于未来发酵豆制品的开发和改进,代谢组学数据可以揭示激活的生化途径和代谢模式的变化。



Introduction
纳豆或发酵大豆,是世界上最古老和最著名的发酵食品之一,被认为是传统的日本料理。纳豆的风味、营养价值和健康益处明显优于未发酵的大豆。众所周知,纳豆含有大量的生理活性化合物,包括维生素K2、纳豆激酶、多糖和蛋白酶,所有这些都对维持人类健康至关重要。为了便于营养物质的吸收和利用,在纳豆发酵过程中,大豆中的脂质、蛋白质和碳水化合物也会被分解。食用纳豆还可以降低餐后血糖水平,这已被证明可以预防糖尿病和血脂异常。因此,它通常被认为是一种具有许多健康益处的食物,包括抗氧化、抗癌、降胆固醇和调节血压的作用。

代谢组学是一种对生物体内代谢物的高通量分析,可以帮助我们更好地了解代谢物在生物体内的变化,并推断生物的生理状态。由于其高灵敏度、高分辨率和一次分析多种代谢物的能力,液相色谱-质谱法(HPLC-MS)经常被使用,特别是在营养和健康领域的非靶向代谢组学。近年来,代谢组学为各种发酵食品的新代谢物的发现及其结构和功能的表征提供了新的视角。

以往的研究表明,通过发酵可以将大豆异黄酮从糖苷形式转化为高活性的苷元形式,从而提高大豆异黄酮的生物活性,从而实现大豆制品中异黄酮的生物转化。异黄酮被肠上皮细胞系统吸收的量和生物利用度决定了它们对宿主健康的影响。

近年来,大豆异黄酮的生物利用度和吸收特性受到越来越多的关注。体外消化是一种有前景的方法,显示出越来越多的潜力,以确定大豆异黄酮化合物的生物利用度,从口服到肠道阶段。据报道,通过在口腔、胃和肠道阶段复制人体消化来吸收大豆异黄酮的过程,为其吸收和使用提供了重要的见解。为了进一步加强这一研究方向,使用体外模拟来评估纳豆在口服、胃和肠道消化阶段的生物利用度和大豆异黄酮的转化(使用LC-MS的代谢变化),作为最近工作的后续研究。此外,利用荧光共聚焦激光扫描显微镜检测了纳豆在消化不同阶段中蛋白质和脂质颗粒的分布。

Results and Discussion
发酵和未发酵大豆的代谢谱
图1的A和B分别显示了负和正PCA得分图。根据第一主成分(PCA1)和第二主成分(PCA2),将两组大豆样品分成几个区域,以强调发酵的效果。PCA1(47.69%)和PCA2(10.32%)在阴性模式下占总方差的58.01%(图1A),而PCA1(75.65%)和PCA2(5.02%)在阳性模式下占总方差的80.67%(图1B)。根据正负离子模式区分每组样品的能力允许对代谢组进行生物信息学研究。数据显示发酵和未发酵大豆之间存在相当大的差异,表明发酵可能显著改变大豆的代谢物。

本研究的PCA结果揭示了不同类型发酵对食品影响的重要见解。虽然这两项研究都证明了发酵对代谢组学谱的有力影响,但具体的方差百分比表明了不同的发酵效应。在本研究中,发酵大豆在PCA分析中表现出更明显的分离,特别是在阳性模式下,PCA1占总方差的75.65%。这表明枯草芽孢杆菌DC-15发酵大豆可能比嗜热链球菌s10发酵牛奶引起更大的代谢组变化。本研究中较高的方差百分比表明枯草芽孢杆菌DC-15诱导的代谢多样性和转化程度更高。此外,比较还揭示了不同的微生物如何影响发酵产品的代谢组学组成。枯草芽孢杆菌DC-15和嗜热链球菌s10通过其独特的酶活性和代谢途径,分别对大豆和牛奶的代谢组学谱有不同的贡献。在发酵大豆中观察到的正负离子模式的巨大变化强调了选择特定微生物以实现所需发酵结果的重要性,这可以显着影响产品的营养和感官品质。

图1  纳豆组和对照组的PCA评分图分别为阴性模式(A)和阳性模式(B);纳豆和对照中处于阴性模式(C)和阳性模式(D)的高级火山图

纳豆的差异代谢物分析
纳豆中表达下调的代谢物水平下降。在阴性模式下共发现299种差异代谢物,其中表达上调125种,表达下调153种(图1C)在阳性模式下共发现351种差异代谢物,表达上调149种,表达下调181种(图1D)。

在本研究中,纳豆中650种差异代谢物在阳性和阴性模式下的鉴定反映了枯草芽孢杆菌DC-15发酵在大豆中的深刻代谢转化。确定的物质跨越了广泛的类别,包括肽、氨基酸、脂肪酸、碳水化合物、类黄酮、维生素和酚类物质。突显了枯草芽孢杆菌DC-15在大豆中引起的代谢改变比昆兹果汁中的微生物作用要广泛得多。

活性差异代谢物的功能和生理意义分析
分析氨基酸、多肽和类似物
图2A显示了大豆发酵前后氨基酸、多肽和类似物的热图。亮氨酸、甘氨酸酪氨酸、甘氨酸缬氨酸只是二肽和氨基酸样物质中的一小部分,还有66种其他物质,包括L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、DL-赖氨酸和脯氨酸。图2D-L显示了升高的肽和氨基酸样化合物,用小提琴图说明了它们的丰度和数据分布。发酵大豆中丙氨酸-谷酰胺上调3.68倍,甘氨酸-缬氨酸上调9.24倍,L-酪氨酸上调1.76倍,DL-赖氨酸上调9.84倍,脯氨酸上调5.93倍。

人体吸收蛋白质的主要形式之一是二肽,它是由两个氨基酸残基组成的寡肽。它们广泛分布于全身,种类和结构差异很大。二肽调节体内许多生理过程,对营养过程至关重要。根据本研究,发酵大豆含有大量的肽和其他氨基酸化合物。被称为肽的小分子通常更容易消化和吸收,由两个氨基酸分子组成。在消化和吸收之后,氨基酸可以用于组织修复和营养代谢等生理功能。发酵显著提高了大豆的营养价值和生物利用度。此外,发酵大豆含有几种独特的化合物,如异黄酮和植酸,它们对健康有好处,以支持肠道健康、激素调节和血糖稳定。

图2  三种类型差异代谢物(A-C)的聚类热图,在聚类热图中,不同的颜色通常代表不同的表达水平或值范围。氨基酸、多肽、脂质等差异代谢物峰面积小提琴图(D-L)

大豆发酵过程中脂肪酸代谢产物
发酵是一种将蛋白质大分子分解成小肽和氨基酸的技术,可以提高大豆的生物价值和营养价值。脂肪酸也是发酵大豆的重要组成部分,发酵大豆是通过化学过程产生的,包括乳糖发酵、脂肪水解或蛋白质水解。枯草芽孢杆菌脂肪酶通过催化脂肪酸水解来提高发酵大豆的脂肪酸含量。脂质和类脂分子的热图如图2B所示,共含有68种活性成分。在发酵大豆中,脂肪酸通常是通过脂肪、蛋白质或乳糖的水解化学产生的。枯草芽孢杆菌产生催化脂肪酸水解的脂肪酶,其中灵芝酸H上调3.68倍,花生四酸上调3.19倍,10-硝基亚油酸上调35.76倍(图2J-L)。其中,灵芝酸H是一种独特的三萜分子,其衍生物具有抗癌、抗炎和降糖作用。

发酵大豆中的其他代谢物
在本研究中,观察了发酵如何影响大豆中的糖、异黄酮和酚类化学物质。观察到某些代谢物的表达在发酵过程中发生了巨大的变化。其他代谢物,如异黄酮、酚类化合物和短分子糖的热图如图2C所示。

首先,在发酵过程中,注意到小分子糖代谢产物D-核糖、棉子糖、蔗糖和杂交糖的上调。假设这可能是由纤维素酶引起的,纤维素酶将大豆中的复杂糖分子分解成这些较小的糖分子。枯草芽孢杆菌DC-15在发酵过程中利用这些糖作为碳源也可能是D-(+)-麦芽糖、水苏糖和海藻糖表达下调的原因。

异黄酮是非甾体类、酚类生理活性物质,具有适度的雌激素活性。最近的研究已经证明了发酵如何改变大豆异黄酮的分布,大大提高了它们的产量和生物利用度,特别是含有糖苷的异黄酮,具有更高的生物活性和消化率。

在本研究中,发现在发酵过程中,虽然更活跃的黄豆苷元形式的黄豆苷元、大豆苷元和染料木素的表达水平升高,但黄豆苷元形式的黄豆苷元、黄豆苷元和鸢尾苷元的表达水平下调。假设发酵过程导致α-葡萄糖苷酶的产生,将异黄酮的糖苷形式转变为苷元形式。这表明发酵是提高大豆异黄酮活性的有效技术。观察到阿威醛的表达下调,儿茶酚、同型香草酸、酪醇和4-甲基儿茶酚的表达过表达。

综上所述,本研究表明,发酵可以显著影响大豆代谢产物的表达,包括糖、异黄酮和酚类化合物。发酵可以提高大豆异黄酮的生物活性,并将大分子糖分解成小分子糖。此外,发酵还可以增强大豆酚类物质如酪醇和同型香草酸的生物活性,为发酵大豆的健康潜力奠定了基础。

代谢途径分析
分析了大豆发酵前后代谢物的差异,代谢物的改变会引起代谢途径的相应变化。因此,利用不同的代谢物来探索受影响的代谢途径,可以进一步了解不同代谢物的相关途径。代谢物分析采用KEGG数据库进行途径富集分析,显著性水平P<0.05。选择前20个显著的代谢途径进行进一步分析(图3A)。结果表明,大豆发酵过程中主要的代谢途径与氨基酸有关,包括β-丙氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、赖氨酸分解合成、甘油、丝氨酸和苏氨酸代谢等。此外,2-氧羧酸代谢、半乳糖代谢、柠檬酸循环(TCA循环)、嘧啶代谢和嘌呤代谢等途径也显著富集。根据KEGG通路富集分析结果,这些代谢通路与代谢物相互作用,最终影响大豆的次生代谢物,如营养成分含量和生物活性成分。此外,这些变化还可能提供潜在的抗氧化、抗肥胖和其他营养功能。

通过Sankey图显示了特定代谢途径的代谢流(图3B)。观察到蔗糖、水苏糖、棉子糖、肌醇等物质在半乳糖代谢途径中富集,而顺式乌头酸和α-酮戊二酸代谢物的变化会影响柠檬酸循环(TCA循环)。此外,L-糖精、戊二酸、N6-乙酰赖氨酸等物质在赖氨酸降解途径中起作用,而胆碱和甜菜碱是甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径中的富集物质。L-天冬氨酸、泛酸、丙二酸、奎宁酸等物质在β-丙氨酸代谢途径中富集,L-糖精和α-酮戊二酸代谢产物在赖氨酸合成途径中发挥作用。上述结果表明,枯草芽孢杆菌DC-15的发酵可以提高大豆的次生代谢产物,这些变化是由不同的代谢途径引起的。不同的代谢途径与发酵过程中微生物的增殖相互作用,这也解释了为什么益生菌的增殖可以影响代谢物的变化。

与未发酵大豆相比,代谢组学分析可以有效揭示发酵大豆代谢物的显著差异。在发酵过程中,枯草芽孢杆菌DC-15影响了大豆的代谢途径,进而影响了大豆的生物活性成分。同时,不同的代谢途径也决定了发酵后代谢产物的差异。

图3  对照与纳豆之间的KEGG富集因子图(A),KEGG差异代谢物图中每个圆圈的颜色和大小分别由P值和途径影响值决定。桑基代谢物和代谢途径图(B)

纳豆在体外消化过程中的变化
纳豆体外消化过程中脂肪和蛋白质的CLSM
激光共聚焦照片显示了大豆和纳豆的不同消化阶段(图4),绿色代表蛋白质的分布,红色代表脂肪的分布,如图4A所示。脂肪和蛋白质在大豆中分布均匀,蛋白质颗粒较大,与大豆颗粒粘在一起;如图4B所示,与大豆相比,蛋白质分布比例更大,蛋白质颗粒更小,脂肪颗粒也更小;在口腔、胃和肠道消化阶段(图4C-E),蛋白质和脂肪逐渐被分解,蛋白质和脂肪颗粒从更聚集的颗粒变为更分散的颗粒,在胃期酸化过程中,由于FITC和尼罗红(绿色到橙色)叠加,脂肪呈现黄色,使FITC荧光强度降低(绿色)。肠期进一步的蛋白质水解和脂质水解也会导致杯状物的稳定性和直径的变化。因此,无论是纳豆还是发酵豆浆,发酵过程都会显著改变其消化后的微观结构。这种一致性强调了发酵在提高大豆及其制品的营养品质方面的普遍作用,特别是在提高其脂质和蛋白质成分的消化率和可及性方面。

图4  体外消化后,纳豆中蛋白质(绿色)和脂肪(红色)颗粒的10倍放大图像

大豆异黄酮在体外消化过程中的生物可及性和生物转化
由于其亲水性和分子量降低,异黄酮苷,特别是大豆苷元和染料木素,比其等效的糖苷更具有生物活性。发酵24 h后,纳豆总异黄酮含量是生豆的1.62倍,糖苷含量是生豆的3.07倍。研究结果表明,枯草芽孢杆菌发酵大豆对大豆异黄酮含量及其生物活性有显著影响,该工艺是提高大豆营养价值和生物活性的可行途径。

在体外消化过程中观察到的异黄酮生物利用度的提高被认为是由于胃相的酸性pH和蛋白质水解酶的作用。这些酶可能会促进大豆基产品中异黄酮的释放和转化,胃液中的低pH值促进异黄酮的水解。水解产生的化合物更容易穿透肠上皮细胞,具有更高的生物利用度。消化液中酶的参与可以破坏异黄酮分子上的化学键,从而产生更小的分子。这些小分子更容易穿过消化道上皮细胞进入血液循环。在体外消化过程中,分别测定了对照组和纳豆在口服期、胃期和肠期的异黄酮含量。各消化期大豆异黄酮含量最高的是胃期,纳豆期和大豆期大豆异黄酮含量分别为154.11和60.93 μg/mL,其次是肠道期和口服期。大部分大豆异黄酮在胃期在纳豆中成功地从糖苷形式(50.04 μg/mL)转化为皂苷元形式(104.07 μg/mL)。这可能是因为胃液的酸性pH值和消化酶的活性,这使得异黄酮在通过胃肠道系统时的稳定性和释放发生了变化。

此外,这一复杂的过程也说明了异黄酮的差异生物可及性的潜力。例如,在酸性条件和酶的影响下,糖苷向苷元的转化强调了消化过程中食物基质相互作用的动态性质。这种相互作用可以通过改善生物活性化合物的释放和吸收,显著影响大豆基食品的营养状况和健康益处。

Conclusion
本研究采用LC-MS比较了纳豆和大豆的代谢组。发酵后,有650种不同的代谢物,包括多肽、氨基酸、脂肪酸和异黄酮。通过KEGG途径富集分析,前20条主要途径显示大豆发酵过程中与氨基酸代谢相关的途径最多,包括β-丙氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、赖氨酸降解、赖氨酸生物合成、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢。2-氧羧酸代谢、半乳糖代谢、柠檬酸循环、嘧啶代谢、嘌呤代谢均显著富集。由于发酵,观察到代谢物的稳定富集和物质的稳定性。异黄酮从糖苷到苷元形式的主要生物转化发生在体外消化的胃阶段。共聚焦图像显示,蛋白质和脂质球被消化和水解,从更聚集的颗粒到更分散的颗粒。这项研究的结果不仅揭示了发酵给豆制品带来的细微变化,而且为实际应用中利用这些变化开辟了道路。为了全面了解,未来的研究结合体外和体内研究是至关重要的,以检查鉴定的代谢物的稳定性,吸收和健康影响。


Metabolic changes and isoflavone biotransformation in natto for improved nutritional distribution and bioavailability

Qi Zhana,b, Kiran Thakura,b, Wang-Wei Zhangb, Jing-Yu Fengb, Jian-Guo Zhanga,b, Mohammad Rizwan Khanc, Zhao-Jun Weia,b,*

a School of Biological Science and Engineering, North Minzu University, Yinchuan, 750021, China

b School of Food and Biological Engineering, Hefei University of Technology, Hefei, 230009, China

Department of Chemistry, College of Science, King Saud University, Riyadh, 11451, Saudi Arabia

*Corresponding author.


Abstract

We used LC-MS to identify the metabolic changes in soybean fermented by Bacillus subtilis DC-15 to comprehend the biochemical alterations. Total 650 distinct metabolites were observed, with amino acids, dipeptides, fatty acids, small molecule sugars, and isoflavones having the largest abundances. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analysis revealed that the primary metabolic pathways involved during the fermentation of soybeans were related to amino acid metabolism, including beta-alanine metabolism, phenylalanine metabolism, glycine, serine, and threonine metabolism. In the gastric phase, the maximum amount of soy isoflavones was successfully converted from its glycoside form (50.04 μg/mL) to the aglycone form (104.07 μg/mL). The distribution of protein and lipid particles in natto during various stages of digestion showed changes from aggregated particles to more scattered particles. For the future development and enhancement of fermented soybean products, our metabolomic data can shed light on activated biochemical pathways and changes in metabolic pattern.

Reference:

ZHAN Q, THAKUR K, ZHANG W W, et al. Metabolic changes and isoflavone biotransformation in natto for improved nutritional distribution and bioavailability[J]. Food Bioscience, 2024, 59: 103937. DOI:10.1016/j.fbio.2024.103937.

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