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非肿瘤的生信分析思路，主要有以下几种
单一疾病WGCNA+PPI分析筛选枢纽基因
个体疾病结合免疫浸润、热基因集、机器学习算法等
两种相关疾病的联合分析，包括非肿瘤合并非肿瘤、非肿瘤合并肿瘤或非肿瘤合并泛癌症分析
基于分类的非肿瘤生物源分析
单细胞结合普通转录组生物信息学分析
目前非肿瘤健生信的门槛较低，欢迎有需要的老师加小科微信讨论最新思路
题目：Identification of novel biomarkers related to neutrophilic inflammation in COPD
期刊：Frontiers in Immunology
分数：5.7/Q2
时间：2024.3.30
研究背景
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是最常见的慢性呼吸系统疾病之一，中性粒细胞炎症在COPD的发生发展中起着至关重要的作用。本研究的目的是通过生物信息学预测和实验验证来鉴定参与慢性阻塞性肺疾病中性粒细胞炎症的新型中枢基因。单细胞RNA测序结果分析显示，COPD样本中上调的基因集与NF-κB信号通路中中性粒细胞炎症反应和TNF-α活化有关。免疫浸润分析显示，慢性阻塞性肺疾病肺组织中性粒细胞上调。作者结合了差异基因和模块化基因的数据，确定了51个与中性粒细胞炎症相关的差异基因。使用孟德尔随机化分析，我们探索了与COPD有因果关系的6个基因。同时，通过PPI网络分析鉴定出11个hub基因，RNA-seq结果显示上述11个基因表达上调。qPCR检测证实了COPD患者外周血白细胞中11个基因中的9个。此外，5个基因与COPD患者的肺功能呈负相关。最后，作者构建了两个更关键的基因转录因子网络，NAMPT和PTGS2。这两个基因可以作为COPD临床严重程度的潜在生物标志物。
研究思路
结果解析
1. 基于单细胞数据的基因集富集分析
我们从GSE173896数据集中获得了4个COPD肺组织样本和3个对照非吸烟者的SRNA-SEQ肺组织样本。质控后，根据特征基因的表达水平将所有细胞分为16个簇，并根据标记基因对14种细胞类型进行注释。然后，作者使用irGSEA软件包根据从MsigDB数据库收集的特征基因集计算每个细胞的基因集富集分数。差异分析显示，COPD样本中有两个特征基因组上调:炎症反应基因。同时，对照样品中有两个基因组明显下调(图3A)。接下来，对不同类型的细胞进行相同的操作，发现这两组基因在中性粒细胞和DC中都上调(图3B)。小提琴和UMAP图谱均显示中性粒细胞中NFLAMMATORY_RESPONSE基因组显著富集(图3C和3D)。
2. 中性粒细胞单细胞数据集富集分析和伪时间分析
中性粒细胞炎症在慢性阻塞性肺疾病的发病机制中起主导作用。作者使用findmarker识别患者和对照组中差异表达的中性粒细胞基因。富集结果表明，差异表达基因集中在与炎症和免疫反应相关的生物过程中(补充图)。因此，作者对所有中性粒细胞的细胞径分化进行了模拟分析。结果显示，蓝色越深，细胞分化越早，表明随着时间的推移，中性粒细胞从左向右分化，最近分化的细胞以最浅的蓝色表示(图4A)。颜色编码的中性粒细胞有三种分化状态，左边的红色是最早的分化类型(图4B)。作者分别研究了中性粒细胞在COPD和对照组的分化过程，发现中性粒细胞在COPD中分化较晚，在对照组中分化较早(图4C)。GSEA对中性粒细胞不同分化状态下伪时间与基因功能关系的研究表明，新分化的中性粒细胞主要与炎症和免疫反应上调有关(图4E-G)。
3. RNA-seq数据的免疫浸润分析
然后，作者利用RNA测序数据，使用CIBERSORT算法计算每个样本中细胞类型的比例，不同的颜色代表不同的免疫细胞(图5A)。在COPD与正常样本中，中性粒细胞、M2巨噬细胞、静息NK细胞和T滤泡辅助细胞4种免疫细胞的比例存在差异。此外，COPD样本中中性粒细胞的比例显著增加(图5B)。在图5C中，相关热图显示中性粒细胞与树突状细胞、CD8 T细胞、T滤泡辅助细胞、NK细胞活化和M2型巨噬细胞呈负相关。相反，中性粒细胞与树突状细胞、单核细胞和活化肥大细胞等三种细胞呈正相关。
4. 筛选与中性粒细胞相关的差异基因
作者对转录测序数据的基因表达矩阵进行了WGCNA分析，根据其相似的共表达特征将其聚类为12个模块(图6C)。模块和性状(中性粒细胞和COPD)的相关性分析显示，MEorangered4和MElightssteelblue1与中性粒细胞显著相关(图6D)。因此，我们选择orangered4模块和lightssteelblue1模块中的基因作为与中性粒细胞相关的必要基因进行进一步分析。转录组学差异分析显示，COPD与正常样本之间共鉴定出827个deg，其中上调基因390个，下调基因437个。Wayne图显示，在获得的scRNA-seq DEGs、RNA-seq DEGs和WGCNA相关模块基因的交叉组中，有33个上调特征基因和18个下调特征基因有显著差异表达(图7A、D)。KEGG通路分析显示，上调的DEGs主要富集在IL-17、NF-κB和TNF信号通路中。同时，下调的DEGs主要富集于氧化和收集导管酸分泌。氧化石墨烯分析显示，上调的DEGs丰富了平滑肌的增殖、分泌和细胞因子活性。下调的deg通过金属离子、晚期核内体和质子跨膜转运体的活性而富集。
5.DEGs与COPD的孟德尔分析
采用MR分析法探讨特征性deg与COPD之间的关系，验证两者之间是因果关系还是相关关系。IVW分析显示，NAMPT、PTGS2、SLC2A3和TRIB1水平与COPD风险增加相关，而CDKN1A和CSRNP1水平与COPD风险降低相关。科克伦Q检验显示这些基因结果没有异质性。MR-Egger回归分析显示，这些基因的结果没有水平多效性(表2)。
6. 枢纽基因的验证
由于中性粒细胞约占外周血白细胞总数的70%，作者从血液样本中分离外周血白细胞，并对白细胞进行qPCR验证枢纽基因。作者收集了27名COPD患者和27名健康人的外周血样本。qPCR结果显示，COPD患者IL1B、CXCL2、PTGS2、MCL1、SOD2、EGR1、NAMPT、CXCL3、ZFP36 mRNA水平较正常人显著升高(图9)。此外，相关分析显示，IL1B、CXCL2、SOD2、NAMPT、CXCL3与COPD患者肺功能呈负相关(图10)。最后，作者根据孟德尔随机化鉴定的6个相关基因与COPD患者外周血中升高的9个基因的交叉，鉴定出两个更关键的基因NAMPT和PTGS2(图11A)，并基于这两个基因构建转录因子网络图，筛选出COPD相关的转录因子。
文章小结
中性粒细胞炎症在慢性阻塞性肺病的病理生理中起着核心作用，并在整个病程中持续存在，但其作用靶点仍然相对缺乏，因此鉴定中性粒细胞炎症的新生物标志物对于开发有效的慢性阻塞性肺病治疗方案至关重要。在此基础上，通过分析COPD和对照肺组织样本的scRNA-seq和RNA-seq数据，作者鉴定出9个与嗜中性粒细胞炎症相关的枢纽基因，其中5个与COPD患者肺功能呈负相关。孟德尔随机化分析进一步证实NAMPT和PTGS2是COPD的危险因素，为COPD中性粒细胞炎症和肺功能的检测提供了一种新的方法。这是非肿瘤性疾病生物源分析的典型方法，从途径筛选到疾病相关特征基因的鉴定，然后用可用的临床样本进行验证。
