2.1引言
大分割放射治疗（RT）首次应用于二十世纪初。从那时起，技术的改进使剂量传递更加精确，减少了对单次大剂量对关键器官有害影响的担忧。同时，需要更好地了解正常和恶性组织中大剂量辐射效应的生物学方面。组织对辐射的反应受到多种因素的调控，包括干细胞祖细胞群、组织微环境（包括基质生态位）以及干细胞间室、基质和免疫微环境之间的主要信号串扰，这些因素不仅是局部的，而且是系统的。最近的研究表明，肠道微生物组在恶性肿瘤中也起着重要作用，不仅是其自然历史，而且对治疗干预的反应。本章将涵盖这些新的生物学因素和机制，以及它们在大分割RT的总体后果中的作用。
2.2大分割辐射的急性和晚期效应
辐射引起的正常组织毒性是有效治疗的主要限制因素。线性二次模型传统上用于模拟常规放射治疗和大分割放射治疗后组织功能损失的等效应剂量。在第1章中，详细描述了该模型的使用。第2章涉及影响辐射引起的急性和延迟毒性的生物功能。辐射引起的急性毒性通常导致过早暂停或停止治疗，减少剂量使肿瘤继续生长或随后增加肿瘤复发的可能性。
辐射引起的慢性或晚期效应可能不会干扰治疗的完成，但会显著降低一些患者的治疗后生活质量。辐射引起的毒性取决于组织类型。肠道或骨髓等器官富含快速自我更新的细胞，对辐射更敏感，经常产生急性毒性。然而，像肝或肺这样的器官，主要是缓慢循环的细胞，容易产生辐射的后期效应，如纤维化。
辐射引起的肠道毒性是对腹部恶性肿瘤进行有效放疗的主要限制因素。即使使用SBRT对此类肿瘤进行精确剂量递送，小肠上皮仍将暴露于辐射。接受腹部放射治疗的患者可能出现厌食、呕吐、腹泻和体重减轻。这些患者有发生急性肠道炎症和粘膜完整性丧失的风险，这也会带来细菌注入和败血症的风险。同样，接受盆腔放疗的患者发生直肠上皮损伤、出血和炎症的风险也增加。对正常组织稳态和损伤过程的详细了解对于制定针对辐射引起的毒性的治疗策略是必要的。
在肠等快速自我更新的组织中，稳态和再生过程主要依赖于组织干细胞的存在。肠内的干细胞位于隐窝的底部。这些细胞分裂并分化为成熟的细胞类型，包括吸收性肠细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞和簇状细胞。多项研究表明，肠道有一个活跃的储备干细胞库。快速分裂的隐窝基柱状细胞（CBCs）主要参与上皮细胞的自我更新。然而，由于其快速的自我更新速度，CBCs对放射或化疗高度敏感。CBCs富含多种细胞表面蛋白，包括LGR5、ASCL2、OLFM4、SMOC2、PROM1和SOX9lo。在过去的十年中，LGR5被广泛用于肠道干细胞的鉴定和表征。LGR5阳性CBCs在再生过程中的重要性及其对基因毒性损伤的高度敏感性使其成为拯救肠上皮免受辐射诱导毒性的主要治疗靶点。储备干细胞池由存在于隐窝基部+4位置的长寿命、大多数静止的干细胞组成。这些细胞可以与更快速增殖的LGR5阳性CBCs相互转化，而静止的这些细胞表达BMI1、MTERT、HOPX、LRIG1、SOX9hi、DCLK1和KRT19作为不同于CBCs的表面蛋白。与LGR5阳性CBCs相比，+4位细胞相对耐辐射。辐射诱导的肠道干细胞DNA损伤和凋亡以及修复和再生过程涉及多种信号通路。
改善辐射诱导的肠上皮毒性的临床/临床前研究主要集中在：(1)肠道干细胞再生，(2)诱导细胞周期阻滞以减少辐射诱导的DNA损伤，以及(3)调节基质信号。从生理生长因子到小分子制剂等几种放射性保护剂已在临床前环境中进行了测试。到目前为止，还没有FDA批准的治疗方法可以保护/减轻辐射引起的肠道损伤。
辐射引起的慢性或长期影响通常包括纤维化，不仅可能发生在肠道，还可能发生在皮肤和皮下组织、肺、泌尿生殖系统以及治疗领域的任何其他器官。辐射诱导的慢性炎症通常导致炎性免疫细胞的积累，这些细胞与内源性促纤维化细胞一起分化，从而获得纤维化表型。此外，成肌细胞产生过多的胶原蛋白和其他细胞外基质（ECM）成分，其后果是由于重塑酶的减少而加剧的。大多数抗纤维化治疗的重点是减少一旦发生的纤维化，这可能有助于避免立即死亡，但迄今为止未能改善患者的生活质量。
SBRT在胃肠道（GI）恶性肿瘤治疗中的应用越来越广泛。目前，对于涉及GI高危器官（OARs）的SBRT，在分割时间表、器官轮廓勾画和用于描述毒性的方法方面存在很大差异。然而，即使使用QUANTEC（临床正常组织效应定量分析）系统，一些OARs对常规分次放射治疗和大分割放射治疗的剂量耐受性也没有很好的描述。HyTEC （High Dose per Fraction, hypofractional Treatment Effect in clinical）倡议最近发表的一篇文章总结了已发表的同行评审临床数据，以进一步完善SRS/SBRT的剂量、体积和正常组织并发症概率（NTCP）和肿瘤控制概率（TCP）的结果估计。HyTEC报告包括针对六个解剖区域的TCP和NTCP的器官/肿瘤特异性论文：颅脑头颈胸椎、腹部、骨盆和脊柱（TCP共9篇，NTCP 7篇）。清楚地了解肿瘤和正常组织的剂量、体积和结局数据对于优化治疗比例和最大化患者的医疗价值至关重要。
2.3肿瘤干细胞：大分割的主要靶点
具有自我更新能力和分化成多个谱系能力的RT细胞被称为干细胞。在许多肿瘤中，具有相似特性的恶性细胞亚群对放射治疗和化疗表现出显著的耐药性。多年来，这些细胞已被确定为癌症干细胞（CSCs），因为它们在治疗后甚至在复发和肿瘤生长中表现出显著的参与。
高自由基清除剂水平和低蛋白酶体活性进一步促进细胞毒性治疗后CSC的存活。尽管许多研究人员对癌症干细胞生物学和命名法的各个方面存在分歧，但显然存在一类肿瘤细胞，它们具有自我更新和分化为促进肿瘤维持的异质谱系的独特能力。研究结果表明，靶向肿瘤干细胞可能改善治疗效果。在对分割放疗的反应中，细胞群变得丰富，细胞表达假定的“干性”标记。具体表型因肿瘤类型和方法而异，但放射后这些细胞的共同特征通常包括存活增加、凋亡减少和H2AX病灶的快速分解（即DNA双链断裂的快速修复）。例如，一项研究表明，放射后神经胶质癌干细胞富集，这些细胞表现出DNA损伤检查点反应的优先激活和DNA修复能力的增加。与常规分割相比，减少分割对CSCs的影响在不同的癌症类型中有所不同。在胶质母细胞瘤中，大分割导致了更糟糕的结果。相比之下，对于其他肿瘤，如非小细胞肺癌，大分割比常规分割效果更好。从这些研究中可以推测，CSCs的放射敏感性和总体存活主要取决于CSCs和分化癌细胞（DCCs）之间的区室平衡。
因此，肿瘤的治疗耐药抵抗性是多因素和复杂的，但CSC处理辐射诱导的DNA损伤的方式可能不同，这一事实应被视为决定分次放疗结果的潜在参数。从本质上讲，如果每次分割辐射的剂量不足以引起CSC群体中足够的细胞死亡，那么在治疗期间肿瘤中CSC的频率甚至可能增加，尽管临床上肿瘤可能在宏观上缩小。
识别有利于或反对CSC生存的信号通路是至关重要的。其中一些通路可以通过大分割或消融的RT来调节。信号通路（图2.1），如SHH、Notch和Oct4，可以作为潜在的CSC靶点来治疗癌症，因为它们促进干细胞增殖。靶向SHH信号也表明自噬调节因子BMI1参与干细胞的自我更新。自噬可以促进或抑制肿瘤的发生。自噬通过降解潜在的致癌分子发挥肿瘤抑制作用。自噬还可以作为肿瘤增强剂发挥作用，通过维持能量产生促进肿瘤生长和治疗抗性，从而提高应激耐受性，促进细胞存活。因此，阻断自噬也可能在治疗上有利。一些放射抵抗肿瘤在常规分割时继续或加速其自噬融合，而大分割可能阻断自噬融合，至少部分克服放射抵抗。然而，用自噬诱导剂对某些肿瘤进行预处理，然后进行大分割放疗，可以通过导致非功能性自噬死亡来增强抗肿瘤效果。
图2.1使CSCs放射增敏的潜在治疗靶点。针对CSC标志物、CSC自我更新途径、CSC生态位、CSC相关EMT和缺氧的治疗可能会使CSC放射敏感。
辐射诱导的从上皮到间充质状态（EMT）的转变可能是最小化CSC群体的另一个潜在目标（图2.1）。EMT促进CSC表型，并可能促进治疗抵抗性的发展。在响应EMT的过程中，发现信号换能器和转录激活因子3 （STAT3）在胰腺癌中促进CSCs。抑制STAT3的DNA结合活性可减少CSCs并增强胰腺癌细胞的放射敏感性。EMT的药物靶向治疗已成功地治疗了多种癌症，并改善了放射治疗的疗效。二甲双胍已被证明可以抑制EMT，增加前列腺癌细胞、结直肠癌细胞和乳腺癌细胞的放射敏感性。CSC生态位本身是使CSC放射致敏的另一个潜在靶点（图2.1）。在实体器官癌症如胶质母细胞瘤中，骨髓来源的细胞提供促进肿瘤复发的信号。这些骨髓来源的细胞有助于形成一个由多种细胞类型组成的CSC生态位，如骨髓来源的抑制细胞、巨噬细胞、纤维细胞、间充质细胞和内皮祖细胞。非消融分割或低剂量大分割RT通过诱导HIF -1依赖性基质衍生因子-1 （SDF-1）的表达促进骨髓源性细胞的募集。
SDF-1与CXCR4阳性骨髓源性细胞相互作用，促进其向辐照肿瘤募集。因此，CXCR4可能是抑制肿瘤复发的潜在靶点。靶向消除CSC血管生态位可能通过减少CSC所需的营养支持和信号分子的分泌来增强RT的有效性。通过抗血管生成药物靶向肿瘤血管生成可显著降低小鼠的CSC数量和肿瘤生长。此外，肿瘤血管的消除促进了CSCs对细胞毒性药物的敏感性。因此，靶向CSC小生境的抗血管生成药物联合放射治疗可能是一种很有前景的癌症治疗策略；但还需要进一步的研究。
更好地了解CSC致敏对大分割RT的潜在治疗靶点可能会导致更安全、更有效的联合策略，从而提高癌症患者的治愈率。
2.4大分割RT与肿瘤微环境
肿瘤微环境（TME）由癌症相关成纤维细胞（CAFs）、上皮细胞（ECs）、间充质基质细胞（MSCs）、免疫细胞及其旁分泌信号（如趋化因子和细胞因子）组成。所有这些都是肿瘤生长和治疗抵抗性的关键决定因素。TME的免疫细胞区室包括肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关中性粒细胞、髓源性抑制细胞、自然杀伤细胞（NK）、T细胞、B细胞、树突状细胞和肥大细胞。不同TME细胞类型之间放射敏感性的差异对治疗结果有显著影响，并可能受到不同剂量分割和放疗计划的进一步调节。
RT可以刺激先天免疫和自适应性免疫，促进抗肿瘤免疫反应。大分割RT对免疫反应的增强作用已被广泛研究，因为它被认为是扩大免疫治疗益处的一种方法。最近的证据表明，大分割RT可能促进或抑制免疫微环境。然而，仍不清楚激活或抑制抗肿瘤免疫反应所需的具体剂量和分割时间表。联合免疫治疗有可能提高大分割RT 的治疗潜力。
放射治疗的免疫反应作用是剂量依赖性的，临床前研究表明，每次分割8-10 Gy或更高的剂量在增强抗肿瘤免疫反应方面更有效。大分割RT除激活DNA损伤介导的细胞死亡外，还可诱导肿瘤细胞免疫原性死亡，促进抗肿瘤免疫应答。免疫原性细胞死亡也与损伤相关分子模式（DAMP）信号和促炎细胞因子的表达有关，从而激活细胞毒性T细胞反应。DAMPs通过toll样受体（TLRs）激活树突状细胞，促进肿瘤抗原的摄取及其在主要组织相容性复合体1类（MHC-1）上的呈递，以激活肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞。许多临床前研究表明，大分割RT可以增加肿瘤抗原对CD8+ T细胞的呈递，增强抗肿瘤T细胞介导的免疫反应。
癌细胞的主要免疫逃避机制之一是免疫抑制分子（如CD47）的表面表达，被称为“不要吃我（don’t eat me）”信号。然而，暴露于大分割RT的肿瘤细胞通常表现出许多免疫原性分子的表面表达，如粘附分子、死亡受体、应激诱导配体、热休克蛋白和刺激分子（如MHC-I和CD80）、HMG®-CoA、Careticulin，统称为“吃我（eat me）”信号（图2.2）。“吃我”和“不要吃我”[eat me and don’t eat me]信号之间的平衡是免疫系统识别肿瘤抗原和T细胞介导的局部和全身肿瘤细胞根除的关键。
图2.2大分割RT对肿瘤微环境的调节作用。大剂量辐照通常显示许多免疫原性分子的表面表达，如粘附分子、死亡受体、应激诱导配体、热休克蛋白和刺激分子（如MHC-I和CD80）、HMG®-CoA、Careticulin统称为“吃我的信号”。这些信号与DAMPs一起激活树突状细胞及其在主要组织相容性复合体1类（MHC-1）上的呈现，以激活肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞。激活的T细胞然后识别表达这些抗原的局部和全身肿瘤细胞并诱导癌细胞死亡。
根据肿瘤的免疫原性和治疗反应性，可将肿瘤分为热肿瘤和冷肿瘤。与热肿瘤相关的TME主要表现为骨髓细胞的炎症表型，高水平的T细胞浸润，大量其他效应细胞，如NK细胞和抗原提呈细胞,
由非常低的T细胞充血和其他具有大量Treg和髓源性抑制细胞的效应细胞组成的TME导致冷肿瘤。虽然大剂量辐射可能是激活免疫反应的最佳选择，但它们也有可能诱导肿瘤血管损伤，限制细胞毒性T淋巴细胞向肿瘤的浸润并促进乏氧。此外，辐射剂量>6 Gy上调内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表达和活性，促进内皮细胞活性和肿瘤新生血管生成。失调的脉管系统的形成导致耐辐射抑制细胞的募集，包括髓源性抑制细胞、treg细胞和M2表型的组织相关巨噬细胞。耐辐射CAFs通过释放由生长因子、蛋白水解酶和细胞因子组成的致瘤旁分泌信号，有利于免疫抑制TME。然而，CAFs的免疫抑制作用取决于放疗的剂量和比例以及特定的肿瘤类型。
综上所述，大分割RT的免疫调节作用显然是双向的，在优化剂量和分割时间表之前，需要进一步了解其机制。
2.5远隔效应/旁观者效应（ Abscopal/Bystander Effects）
虽然对肿瘤微环境的关注主要局限于局部反应，但越来越多的人认识到，也可能存在肿瘤的外显效应。1953年，“abscopal（远位的）”一词首次被用来指远离辐射暴露野的组织受到的辐射效应（the radiation effect to a tissue distant from the radiation exposure field）。辐射诱发的旁观者效应被定义为在未直接暴露于辐射但靠近受辐射细胞的细胞中表达的生物效应(Radiation-induced bystander effects are defined as biological effects expressed in cells not directly exposed to radiation but in close proximity to irradiated cells.)。
细胞间通讯是介导旁观者效应的关键。电离辐射的影响通过附近受照射细胞的旁分泌信号传递给这些未受照射的细胞。这些旁分泌信号调节增殖、分化、静止或凋亡（These paracrine signals modulate proliferation, differentiation, quiescence, or apoptosis. ）。到目前为止，已经确定以细胞因子、趋化因子和代谢物形式的分泌因子携带关键信号，诱导局部旁观者效应和远处旁观者效应。例如，辐射诱导释放TNF-α和TRAIL作为主要的旁分泌信号，促进细胞凋亡。
旁观者效应有许多相关的现象，包括自适应性反应、基因组不稳定性和远隔效应（ adaptive response, genomic instability, and abscopal effects）。此外，个体之间的遗传变异可能进一步影响正常组织附带损伤和有益的旁观者/旁观者效应。
1992年，Hatsumi Nagasawa和John B. Little首次报道了辐射诱导的旁观者效应。在随后的多篇报道中，已经证明，没有被α粒子直接击中但在被击中粒子附近的细胞也有助于细胞群体的遗传毒性反应。同样，当细胞被照射后，将培养基转移到未照射的细胞中，这些未照射的细胞在克隆存活和致癌转化的检测中表现出旁观者反应。这些观察结果也归因于旁观者效应。
空间分割网格放射治疗（spatially fractionated grid radiation Therapy，SFGRT）很好地说明了旁观者效应，其中只有部分肿瘤/靶标区域接受高剂量的大分割照射，而其余靶标区域接受低剂量的照射。一项临床前研究进一步证实了双侧A549肺腺癌异种移植瘤小鼠的旁观者效应和旁观者效应。在本研究中，小鼠在未照射的右侧肿瘤中，先接受15 Gy的SFGRT，然后在左侧肿瘤中接受5次2 Gy的SFGRT，观察到最大的远隔效应，这表明SFGRT与常规分割的序贯组合可以放大远隔效应。采用LATTICE治疗双侧Lewis肺癌（LLC）的小鼠也获得了类似的结果。
将SFGRT与高剂量放疗对肿瘤总体积的影响与对部分肿瘤体积的影响（10%、20%和50%）进行比较。在放疗（20 Gy）达到肿瘤体积10%的肿瘤中，以及细胞因子反应和CD3+ T细胞浸润水平最高的未放疗肿瘤中，观察到最大的消退。这些结果清楚地表明，针对部分肿瘤体积的高剂量放射治疗比针对整个肿瘤体积的放射治疗能引起更强的免疫刺激。因此，SFGRT可以被认为是促进旁观者效应和远隔效应的最有效方法之一。在远离辐照野的病变中观察到的抗肿瘤免疫是远隔效应的一个主要例子。辐射诱导免疫细胞浸润的改变和免疫细胞表型（如巨噬细胞和淋巴细胞）的改变可产生抑制未辐照肿瘤和转移的全身性作用。临床前研究表明，放射具有局部抗肿瘤作用，具有初始免疫启动和随后的免疫效应功能。然而，这种局部免疫反应可以携带记忆，并在同一动物中对肿瘤再攻击表现出全身反应。这种局部抗肿瘤免疫反应也已扩展到局部或远处的野外病变。这种全身的抗肿瘤体液反应可以看作原位自体肿瘤疫苗，也可以被认为是与免疫治疗的组合策略。正在临床前研究和临床试验中对使用SBRT增强抗肿瘤免疫进行测试。临床研究表明，患者外周血样本中免疫活性CD8+细胞毒性T细胞增加，治疗方案为60 Gy分8次或50 Gy分4次。令人印象深刻的是，这些变化早在SBRT完成后72小时就很明显，并持续长达6个月。一些研究还表明，接受2次30 Gy或4次32 Gy的SBRT治疗的肾癌患者，未照射病变完全消退。一项临床前研究表明，在小鼠MC38腺癌细胞系中，1次8 Gy的剂量可以通过上调MHC1抗原呈递分子来增加免疫识别。这些研究表明，大分割可能会诱导树突状细胞的募集，从而增强免疫细胞信号对肿瘤抗原的可见性，从而促进抗肿瘤免疫，即使在未照射的病变中也是如此。尽管这些观察结果令人鼓舞，也有报道显示SBRT具有免疫抑制作用，因此需要进一步研究以提高我们对剂量和治疗时间的影响的理解。此外尚不清楚，SBRT免疫调节作用的生物学机制。因此，在临床研究的同时，还需要进行额外的机械性临床前研究。
个体分割之间的间隔现在被认为是保持先天免疫功能和调节整体肿瘤控制的关键因素之一。与每天或4天的间隔相比，接受抗PD1和放疗联合治疗的小鼠，间隔10天的放疗间隔较长，肿瘤控制效果更好。这种个性化超分割立体定向自适应性放射治疗（PULSAR）已经在几个早期临床试验中进行了测试，预期较长的治疗间隔将与检查点抑制剂治疗更好地协同作用，最大限度地减少急性毒性，并最终提供更好的转移性癌症控制。转移性肾癌或前列腺癌患者对PULSAR的反应表现出更好的肿瘤控制，且无任何副作用。虽然需要进一步研究，但现有证据表明，延长辐射分割间隔可能提供更好的局部和全身效果。
2.6微生物组：对大分割放疗的影响
对宿主微生物群、肿瘤和放射治疗之间的相互作用将影响临床结果的更好理解正在出现。迄今为止的研究大多采用标准分割法来证明肠道原体可能被改变为炎症激活模式，这可能有助于免疫细胞的募集和减少肿瘤的免疫抑制性质。最近的证据还表明，肠道微生物群的组成可能反过来影响对辐射的反应。临床前研究表明，微生物群可以改变，以提高大分割放疗的疗效。
万古霉素（Vancomycin）是一种主要作用于革兰氏阳性菌的糖肽抗生素，在小鼠中口服万古霉素，可诱导大分割RT对黑色素瘤、肺癌和宫颈癌的抗肿瘤作用。这种效果需要一个功能正常的免疫系统，也可以通过丁酸钠（sodium butyrate）治疗来消除，丁酸钠是革兰氏阳性细菌的关键代谢物。这意味着革兰氏阳性肠道微生物组介导肿瘤微环境的重塑，增加邻近淋巴结的抗原呈递，并最终提高放射治疗对原发肿瘤的有效性。实现类似反应的更实用的方法可能是使用广泛使用且安全的抗生素万古霉素，以提高大分割放疗的疗效。最近的报道表明，肠道微生物组也调节辐射诱导的毒性。具有良好临床结果的患者可能更多地受益于特定因子丰度的显著变化。
微生物组正成为提高放疗治疗率的潜在治疗靶点。在过去的十年中，一些临床和临床前研究证实，微生物组的组成是正常和恶性组织放射敏感性的主要决定因素之一。然而，在开发一种针对微生物组或基于微生物组的综合治疗方法成为现实之前，有许多悬而未决的问题需要回答。剂量和剂量分割对微生物组组成的影响很可能是提高治疗比率的关键。因此，重要的是，正在进行的研究包括在常规分割之外使用大分割RT，以确定微生物组参与局部和全身辐射效应，以及辐照组织和微生物组之间的关键信号串扰。
2.7总结
大分割放疗新应用的成功将取决于多种生物或生理因素，如癌症干细胞生态位、肿瘤微环境、免疫反应以及治疗的急性和晚期效应。因此，在使用大分割和SBRT来改善患者医疗和预后方面的持续进展，将在很大程度上依赖于对大分割RT相关生物学机制的持续阐明。
