前言
来源于药用植物的天然产物是一种具有广泛生物活性的化合物类，在制药、食品和化妆品行业中发挥着关键作用。由于其出色的生理功能，人们对植物天然产物（PNPs）的生物合成途径越来越感兴趣（Kawatra et al.， 2022; Halder and Jha, 2023）。然而，随着市场需求的持续增长，传统的采收和植物提取方法对环境造成了巨大的压力（Singh, 2023）。近年来，合成生物学的迅速发展为利用生物技术生产结构复杂、具有生物活性的小分子化合物提供了新的途径（Hesami et al.， 2023）。然而，对生物合成途径的了解不足严重阻碍了从药用植物中大规模生产天然产物。与微生物不同，植物天然产物的生物合成基因在染色体上分布相对分散，而且药用植物通常缺乏有效的遗传操作系统，这阻碍了对它们生物合成途径的阐明。最近，基于活性探针的化学蛋白质组学在阐明植物次生代谢物（如甜叶菊苷、喜树碱、查尔莫拉辛等）的生物合成方面显示出巨大的潜力，因为它能够快速识别与底物相互作用的功能蛋白质，从而加速发现生物合成途径（Li et al.， 2018; Zhou et al.， 2018; Gao et al.， 2020; Wong et al.， 2020; Zhang et al.， 2024）（图1）。图 1 。(A) 采用化学蛋白质组学方法来鉴定参与植物天然产物生物合成的酶类。(B) 已报道的基于光亲和性的酶探针。传统的方法在推进我们对植物天然产物生物合成途径的理解方面发挥了关键作用，为新兴技术如化学蛋白质组学奠定了基础。例如，基因敲除和RNA干扰（RNAi）方法已被广泛应用于通过观察特定基因沉默后代谢物生产的表型变化来识别参与生物合成途径的基因（赵等人，2016年）。此外，多组学方法，如转录组学，通过基因共表达提供见解，尽管这些方法可能受到需要进行大量数据分析的限制，并且不能直接识别酶活性（刘等人，2024a；Swamidatta和Lichman，2024）。异源基因表达，通常在微生物和植物系统中进行，通过在非原生植物背景下重构生物合成途径，使我们能够对单个基因或基因簇的功能进行功能分析（Lau和Sattely，2015; Hong et al.， 2022; Yang et al.， 2024）。然而，用于验证酶功能的传统生化分析可能需要大量纯化的蛋白质，这是一个耗时的过程（Tatsis et al.， 2017）。这些方法虽然是基础性的，但往往无法直接解析植物体内复杂的代谢途径。而化学蛋白质组学（Chemoproteomics）则凭借其基于活性的探针和功能注释能力，在解析植物体内代谢途径方面展现出独特的优势。因此，将化学蛋白质组学技术应用于全面分析植物次生代谢物的生物合成不仅具有实用价值，可以快速识别参与生物合成的功能基因，而且在通过合成生物学实现大规模药物植物次生代谢物生产方面具有战略意义（张等，2022年；高等，2023年；刘等，2023年；张等，2023年；戈卢波娃等，2024年；蒋等，2024年；刘等，2024b年）。亲和探针是一种用于化学蛋白质组学的特殊化学工具，用于从复杂生物样品中分离和鉴定活性酶，特别是那些参与植物次生代谢物合成的酶。这些探针通常由一个靶向酶活性位点的结合基团、一个激活后通过共价结合实现酶捕获的活性基团以及用于检测的报告基团组成。有效的亲和探针设计需要具有模仿天然底物的特异性、在生物条件下的稳定性以及可控的反应性，以确保选择性且持久的结合（帕克和普拉特，2020；方等，2021）（图2）。亲和探针的主要优势在于它们能够选择性地靶向并捕获天然蛋白质组中的活性酶，从而避免了需要进行大量纯化或基因操作的限制。然而，诸如非特异性结合和探针设计复杂性等挑战可能会限制其有效性（塔巴纳等，2023）。亲和探针已被证明在植物次生代谢物合成途径的绘图方面具有不可估量的价值，如在合成儿茶素葡萄糖苷和其他复杂天然产物的酶的研究中所展示的那样。![]()
图 2 亲和探针的工作流程
3 甜菊糖苷合成中的3种UDP糖基转移酶
来自Stevia rebaudiana的甜味剂——甜菊糖苷由于其作为非热量甜味剂的潜力而受到广泛研究（Masand et al.， 2024）。利用基于化学蛋白质组学的策略的最新研究成功地鉴定出了参与甜菊糖苷糖基化的UDP-糖基转移酶（UGTs）SrUGT73E1、AtUGT73C1和AtUGT73C5（Li et al.， 2018; Zhou et al.， 2018; Wong et al.， 2020）。使用特异性针对甜菊醇的光亲和探针结合质谱技术，研究人员能够特异性地分析负责最终糖基化的UGTs。该发现不仅有助于我们更好地理解甜菊糖苷的生物合成途径，还为快速识别参与糖基化的其他酶提供了新的平台，从而为大规模生产提供了合成生物学方法。
4 通过FAD依赖的环加成进行查尔科莫拉辛的生物合成
栗褐素是一种从桑树（Morus alba）中分离出的生物活性黄酮类化合物，通过一种高度独特的依赖黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的分子间狄尔斯-阿尔德反应合成。多年来，尽管这种环加成反应对于栗褐素的特征性环己烯环的形成至关重要，但负责这一反应的酶一直未被发现。最近的研究通过基于生物合成中间体探针（BIP）的化学蛋白质组学策略（Gao等人，2020），在植物中发现了一种新型酶——Diels-Alder酶（MaDA）。MaDA以高度特异性和对映选择性催化[4 + 2]环加成反应，标志着首次在植物中发现独立的分子间Diels-Alder酶（Gao等人，2020，2024）。在这种情况下使用化学蛋白质组学方法使我们能够对这种酶的功能进行表征，由于植物生物合成途径中缺乏基因簇，因此这种酶无法通过传统的基因组学或转录组学进行研究。5-喜树碱生物合成及其中OpCYP716E111的作用喜树碱（Camptotheca acuminata）和蛇根草（Ophiorrhiza pumila）是一种具有有效抗癌特性的生物碱（Yang et al., 2021）。喜树碱的生物合成长期以来一直是一个研究课题，在了解严格胺形成后的步骤方面存在重大差距。OpCYP716E111的发现带来了一个突破，OpCYP716E111是一种环氧化酶，负责催化严格胺转化为严格胺环氧化物。利用化学蛋白质组学方法，研究人员设计了一种针对strictosamide的基于偶氮嘧啶的探针，该探针能够在蛇根（Ophiorrhiza pumila）的蛋白质组中选择性鉴定OpCYP716E111 （Zhang等，2024）。这一发现填补了喜树碱生物合成途径的关键空白，并强调了化学蛋白质组学在揭示复杂植物代谢过程中先前未知的酶方面的力量。
6. 化学蛋白质组学在植物生物合成中的广泛影响
甜菊糖苷、查尔科莫拉辛和喜树碱的发现突出了化学蛋白质组学在植物天然产物生物合成领域的广泛适用性(Li et al., 2018；Zhou et al., 2018；Gao et al., 2020；Wong et al., 2020；Zhang等人，2024)。由于生物合成基因的分散性，转录组学和基因敲除研究等传统方法在植物中往往不奏效，这使得很难确定每一步的酶。化学蛋白质组学通过小分子探针直接靶向酶活性，从而避免了这一问题，即使在非模式植物中也可以快速注释酶的功能。这种方法在次要代谢基因没有组织成簇的植物中特别有利，这在微生物系统中很常见，但在植物中很少见。化学蛋白质组学为研究生物合成途径提供了独特的优势，例如在不需要基因克隆或蛋白质表达步骤的情况下检测低丰度酶的高灵敏度。它还可以区分密切相关的异构体，并同时分析多种酶，从而全面了解植物系统中的代谢网络。这些特点使得化学蛋白质组学对推进天然产物生物合成的研究特别有价值。此外，化学蛋白质组学与合成生物学的结合为可持续生产这些有价值的化合物提供了希望。通过鉴定和表征参与天然产物生物合成的酶，研究人员可以在微生物宿主中重建这些途径，从而实现复杂植物衍生化合物的可扩展和可控生产(Zhang et al., 2022；Gao et al., 2023)。
尽管化学蛋白质组学具有优势，但在研究复杂的植物生物合成途径方面仍面临挑战。这些问题包括探针的非特异性结合，需要在非模式植物中进行广泛的优化，以及依赖高质量的质谱数据进行准确的酶鉴定。此外，探针设计的限制可能会影响结合效率和特异性。未来的进展，如提高探针选择性和与其他组学技术的整合，有望克服这些障碍，提高该方法在生物合成研究中的实用性。化学蛋白质组学已被证明是阐明复杂天然产物如甜菊糖苷、查可莫拉星和喜树碱的生物合成途径不可或缺的工具。直接分析参与这些途径的活性酶的能力为植物天然产物的研究提供了一个新的前沿，加速了关键生物合成基因的发现并促进了它们在合成生物学中的应用。随着这一领域的不断发展，化学蛋白质组学可能在释放植物源性天然产品的全部潜力方面发挥核心作用，用于制药和工业应用。
