Fabrizio Salonia1,2, Angelo Ciacciulli1, Lara Poles1,2, Helena Domenica Pappalardo1, Stefano La Malfa2* and Concetta Licciardello1*
1CREA - Research Centre for Olive, Fruit and Citrus Crops, Acireale, Italy
2Department of Agriculture, Food and Environment (Di3A), University of Catania, Catania, Italy
新的植物育种技术(NPBTs)旨在克服果树物种的传统育种限制,以获得具有改善感官性状和抗生物和非生物胁迫的新品种,并保持几个世纪以来通过(克隆)选择实现的果实质量。关于控制特定性状的基因的知识对于使用NPBTs(如基因组编辑和同源基因改造)至关重要。在包括柑橘在内的果树物种的国际科学界工作框架内,NPBTs主要用于应对病原体威胁。柑橘由于其复杂的物种生物学(无核、无融合、高杂合度、幼期长)和体外调控的能力,可以利用NPBTs。据我们所知,通过转基因对柑橘进行基因组编辑,利用抗性基因CsLOB1成功地诱导了甜橙和葡萄柚对柑橘细菌溃疡病的抗性。未来,NPBTs还将用于改善水果性状,使其更健康。NPBTs应用后的植物再生是一个瓶颈,因此有必要优化现有协议的效率。将讨论使用来自年轻试管苗和来自成熟植株的外植体的优点和缺点。本综述中涉及的其他主要问题涉及对无标记系统的要求和缩短漫长的幼龄期。本文旨在总结文献中适用于柑橘的方法和途径,重点介绍在使用NPBTs之前观察到的原则。
前言
柑橘属芸香科,是世界上最重要的水果作物之一。柑橘类水果是宏观和微量营养素(Ting, 1980)和膳食纤维的来源(Marín等,2007)。它们还富含抗氧化剂化合物(Liu et al., 2012),揭示抗癌和抗炎特性(Ma et al., 2020),并可有效降低心脑血管疾病、骨质疏松症和2型糖尿病的风险(Yuan et al., 2003; Tripoli et al., 2007; Benavente-García和Castillo, 2008; Sugiura等人,2012; Cirmi等人,2016; Sugiura等人,2016)。
柑橘与其他木本植物一样,幼年期长,杂交和异交广泛,种群结构减少。大多数栽培柑橘品种都是由它们的野生祖先驯化而来,或者经过杂交繁殖。近年来,柑橘的驯化研究越来越多,有助于阐明栽培种的起源。这为野生资源如何有助于改善现有品种提供了全面的资源(Wu et al., 2014; Wang et al., 2017; Wu等人,2018; Ahmed et al., 2019)。
传统育种是提高农艺性状的主要策略之一。在许多柑橘物种中,有几个品种是通过常规方法开发的,如诱变、种间和种内杂交以及克隆选择(Caruso等人,2020年)。其目标是生产高质量的柑橘类水果(在大小、糖和酸度平衡、果汁产量和无核方面),这些水果健康且富含抗氧化物,能够耐受或抵抗不同的非生物和生物威胁,并且具有高产量。传统的柑橘育种是一个长期而昂贵的过程;获得后代和评价后代的性状需要较长的时间和资源。此外,有性繁殖并不总是可行的,因为一些用于杂交的品种是不亲和的、不育的或多胚性的(Talon和Gmitter, 2008)。此外,在许多情况下,育种后需要进行回交以恢复改良品种的优良特征,从而延长了更多的育种计划。在砧木育种 rootstock breeding的情况下,这个过程也可以更长(25年或更长)。传统选育方法的选育效率相对较低,但迄今为止,大多数新品种和砧木在柑橘农业中得以应用。
20世纪90年代以来,分子标记、基因组定位、测序、离体培养等新技术被应用于育种,为新品种的改良提供了替代传统方法的有效途径。此外,转基因已使许多商业品种和新的砧木在柑橘农业中得以应用(Gentile et al., 2007;La Malfa等人,2011),特别是提高了对生物和非生物胁迫的抗性。通过开发涉及农杆菌感染或聚乙二醇(PEG)介导的DNA摄取过程的转化方案,这已经成为可能,从许多外植体来源开始,如上胚轴和节间或胚性细胞悬液和原生质体。
近年来,一些新技术被开发出来并被归类为植物新育种技术(NPBTs)。这些包括(I)锌指核酸酶技术,(II)寡核苷酸定向诱变,(III)顺基因发生,(IV)内基因发生,(V) RNA依赖的DNA甲基化,(VI)转基因砧木嫁接,(VII)逆向育种,(VIII)农业渗透,以及(IX)合成基因组学(Lusser et al., 2011)。然而,NPBTs的效率需要有关重要园艺性状遗传控制的知识,与其他主要作物相比,柑橘的遗传控制知识仍然有限。在过去的20年里,不同技术和测序平台的发展导致了一些园艺物种的基因组的发表(图1)。就木本植物而言,迄今为止,NPBTs的主要应用之一是改善与生物和非生物抗胁迫相关的农艺性状(图2)。到目前为止,根据GMO 2001/18立法,NPBTs被裁定为转基因生物(GMO)。因为它们属于重组DNA技术。欧洲正在进行几场辩论,以确定NPBTs方法本身或其产品是否可以接受不同的协议,以独立于转基因生物监管。
图1 2000-2020年的一些主要植物基因组测序,包括柑橘及其相关属(底部为蓝线)和其他作物(上方为红线)。
图2通过应用植物新育种技术获得的基因组修饰方法通过示意工作流程进行说明。在“同源基因改造”中,新性状来自于性兼容的物种,并将其与启动子和终止子一起原封不动地转移给受体。“基因编辑”需要使用Cas9来修改专门设计在目标基因上的引导RNA (gRNA)。“碱基编辑”是由具有保守特异性DNA结合能力的死酶或切割酶Cas9和碱基修饰酶(如腺苷和胞苷脱氨酶)组成的嵌合蛋白的作用。在每种方法下面,报告了控制几种果树作物特定性状的主要靶基因列表,并提供了相应的参考文献。
本综述的目的是描述NPBTs在柑橘和其他果树物种上的应用现状和最新进展,特别是在基因组编辑和同源基因改造方面。我们强调了这些技术的技术、应用和立法方面,以及应用NPBTs来改善水果质量性状的潜在优点和缺点,由于抗氧化剂的含量更高,使它们更健康。
世界植物育种新技术现状
NPBTs为提高生物和非生物抗性、营养质量和作物性能提供了替代方法(Cao等人,2016;Lassoued等人,2018);其中,基因组编辑和同源基因改造代表了开发遗传改良林木作物的两种最有前途的策略。基因组编辑涉及通过细胞中的DNA修复系统,在基因组的精确位置产生特定的、稳定的和可遗传的突变,在不留下外源DNA的情况下,诱导不希望出现的错误(脱靶效应)的概率很低。同源基因改造涉及由相互兼容的物种产生的基因转移。NPBTs代表了传统育种的创新替代方法,过程更短(尽管这只适用于果树和木本植物),作用机制更精确。NPBTs对选定的基因型(如优良品种)进行了有针对性的和最小程度的修改,这些品种因其质量和生产力而受到消费者的高度重视,但还可以进一步改进。与传统育种方法不同,与转基因方法类似,NPBTs不会改变遗传背景,这对优秀品种尤其重要。体外培养、基因组测序和功能研究的进展有助于提高分子育种技术在许多作物中的应用。许多使在植物中使用NPBTs可行的方法和协议,包括工程质粒的可用性、有效的农杆菌介导的转化和来自成熟植物的再生协议,已经在转基因方法中得以开发。
最近,欧洲和非欧洲国家独立或协调地支持使用NPBTs来改善几种作物的性状。GENIUS (2012-2019, https://www6.inra.genius-project_eng/)和BIOTECH (2018-2021, https://www.politicheagricole.it/flex/cm/pages/ServeBLOB.php/L/IT/IDPagina/9613)分别是法国和意大利的项目,展示了目前应用于传统当地作物植物的NPBTs。GENIUS解决了使用基因组编辑技术来减少农药使用和减缓气候变化以实现更可持续农业的问题。用于概念验证的实际评估性状包括对生物和非生物胁迫的抗性,开花时间和植物结构控制,几种草本、园艺、观赏和水果物种(如水稻、小麦、玉米、番茄、土豆、油菜、玫瑰、杨树和苹果)的植物繁殖机制。BIOTECH专注于基因组编辑和同源基因改造的应用,以改善水果的定性性状,抗生物和非生物胁迫,以及地中海主要作物的结构,如水稻,小麦,大麦,番茄,茄子,罗勒,葡萄,柑橘,桃子,苹果和杨树。GENIUS由法国国家研究机构创立,而BIOTECH由意大利农业部资助。此外,俄罗斯还宣布了一项联邦计划,目标是在2020年之内在作物和动物中创造10个基因编辑的新品种,到2027年再创造20种作物(Dobrovidova, 2019)。相反,荷兰的一个项目(2006-2016,https://www.wur.nl/en/Research-Results/Research-Institutes/plant-research/DuRPh.htm) DuRPh(对疫霉菌的持久抗性)旨在从可杂交的野生物种中培育携带多种晚疫病抗性基因的顺基因马铃薯。在一个欧洲小组的框架下,种植(2019-2023,https://plantgenomeediting.eu/ CA18111)是一项成本行动,旨在评估植物基因组编辑的全部创新潜力和影响,确定未来的研究重点方向,以社会负责任的方式促进研究和创新之间的联系,并研究密切相关领域之间的协同作用。此外,国际社会也正在努力制定短期、中期和长期战略,以预防并最终面对黄龙病(HLB)相关的风险,这是世界上最具破坏性的柑橘疾病。鉴定抗性和易感基因以及应用NPBTs在不久的将来生产抗性柑橘植物只是地平线2020项目“ephlb”的部分目标——预防HLB流行以确保欧洲柑橘的生存(2019-2023年)。最后,美国农业部(USDA)资助了旨在工程化纳米材料或确定将CRISPR-Cas9载体和/或核糖核蛋白(RNPs)传递到植物细胞核的方法的项目,旨在加速新作物品种的开发(https://nifa.usda.gov/program/plant-breeding-genetics-genomics-programs)。
对NPBTs的监管一直是世界范围内讨论的话题。讨论的关键点涉及两个方面,考虑到所使用的方法或最终产品的特性。这两个方面的关键问题的解决使NPBTs的加工或产品被考虑,并因此被裁定为转基因或非转基因。Eckerstorfer等人(2019)分析了不同国家对转基因生物的监管框架,并评估了基于过程还是基于产品的NPBTs对NPBTs应用的监管更有帮助。由此得出的结论是,两种制度都不能被认为是优越的。此外,世界各地对NPBTs的监管不同(Eckerstorfer等人,2019;Friedrichs et al., 2019)。在美国,NPBTs作物不受美国农业部严格的规章制度的约束(Waltz, 2016),认为基因组编辑是一种传统育种方法,只是速度更快。然而,美国农业部宣布,基因组编辑方法产生的产品应根据具体情况进行考虑(Lusser和Davies, 2013;Voytas和Gao, 2014;Jones, 2015)。相反,在欧洲,欧盟法院(CJEU)(案件C-528/16, 2018年7月25日发布的裁决)宣布NPBTs应被视为转基因生物。这样,NPBTs受制于指令2001/18/EC的义务,其中转基因生物是其遗传物质已被改变且不是通过自然繁殖和/或重组获得的生物。
同源基因改造在果树品种中的应用实例
同源基因改造一词最早是由Schouten等人在2006年提出的,他将其定义为“使用仅来自物种本身或来自可以与该物种传统杂交的物种的基因对植物进行基因改造。”根据上述定义,同源基因改造cisgenesis涉及基因(包括内含子)及其控制序列(启动子和终止子,在意义方向上)从一个基因型转移到另一个相同或性兼容物种的基因型(Schouten et al., 2006;卢瑟和戴维斯,2013)。Cisgenesis可以克服传统育种的主要瓶颈,称为“连锁阻力”(不需要的基因转移与感兴趣的基因),允许转移感兴趣的基因,而不需要其他遗传区域控制不需要的性状(Jacobsen和Schouten, 2007)。因此,cisgenesis所考虑的基因库理论上也可以通过经典育种方法进行转移(Holme et al., 2013)。然而,cisgenesis有几个缺点,这限制了它的广泛应用。特别是,顺基因在宿主基因组中的随意插入可能会导致负面影响(Vanblaere et al., 2014),并可能中断或修改基因或基因间相关序列。许多沉积的基因组提供了基因信息和相关注释,可用于顺基因方法;然而,在许多情况下,缺乏有效的启动子和可选择的标记仍然是该技术应用的主要瓶颈(Limera et al., 2017)。此外,将被整合到宿主基因组中的基因拷贝数可能是另一个缺点,即使已经报道了转基因和内变性的明显相关性(Jones et al., 1987;Zanek等人,2007;Zeng et al., 2009;Joshi et al., 2011)。迄今为止,鲜有顺基因植物的报道,它们几乎只存在于苹果和葡萄中,旨在诱导对赤霉病的抗性(Joshi et al., 2011;Vanblaere等人,2011;Vanblaere等人,2014;Gessler等人,2014)和苹果的火枯病(Krens等人,2015;Würdig et al., 2015)以及葡萄白粉病(Dhekney et al., 2011)(图2)。
基因组编辑技术与方法
基因组编辑技术是精确处理作物改良目标序列的有效工具(Arora和Narula, 2017;Limera等人,2017)。这些技术允许在不引入额外DNA的情况下编辑、删除和替换基因组位点的目标位点中的特定序列。这些技术诱导双链断裂(DSB),然后通过非同源端连接(NHEJ)和同源定向修复(HDR)过程进行“修复”(Gaj等人,2013;丹尼尔,2013;Fauser等人,2014;里纳尔多和埃利夫,2015)。锌指(ZF)和转录激活物样效应物(TALE)是第一个用于靶向诱变的工程核酸酶。这些核酸酶识别一个(TALE)或三个(ZF)核苷酸的特定目标DNA序列,提供一种核酸酶,破坏识别区附近的DNA (Gaj et al., 2013)。CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat-associated protein 9)是一种革命性的分子工具,最初被发现用于防御病毒感染(Mojica et al., 2000)。该技术通过引导RNA (gRNAs)工作,其特征是根据基因组中的目标设计特定的序列。Cas核酸酶(通常表示为Cas9)在gRNA引导下,在gRNA退火位置附近产生DSB,允许目标特异性突变。CRISPR/Cpf1(另一种CRISPR/Cas系统)更有效(Ledford, 2015;Zetsche等人,2015;Fonfara等人,2016;Jia等人,2019),克服了Cas9的几个局限性。
在植物中,自然发生的DNA双链断裂发生,在缺乏外源供体序列的情况下,它们主要由NHEJ重新连接。这个过程很容易出错,在原始序列中确定小的突变(如插入和删除引起的移码),并导致目标基因功能的丧失,最终导致表型突变。这类似于诱变的过程(通过化学或物理诱变剂);然而,在基因组编辑方法中,诱导突变不是随机的(如经典突变),而是局限于已知功能的特定基因。此外,在传统的随机诱变中,除了不需要的突变外,还需要对诱变种群进行大规模筛选,以检测携带感兴趣突变的植物。相反,CRISPR/Cas9也可以与与目标序列同源的特定DNA片段相关联。
CRISPR/Cas9技术的主要优势之一在于其(相对)易于工程,只需修饰17-20 bp的CRISPR RNA (crRNA),部分引导RNA (gRNA),特异性,并与感兴趣基因的目标DNA互补。有几种工具可用于协助gRNA设计,并用于用于工厂改造的结构的硅组装。一些最常用的工具是Benchling (www.benchling.com)、GoldenBraid 4.0 (www.gbcloning.upv.es)、CRISPR- p 2.0 (www.crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR)、CRISPRdirect (www.crispr.dbcls.jp)、Chop-Chop (www.chopchop.cbu.uib.no)、E-CRISPR (www.e-crisp.org)、CRISPR- ge (www.crdd.osdd.net/servers/crisprge)、CRISPR RGEN tools (http://www.rgenome.net)和CRISPOR (http://www.crispor.tefor.net)。
然而,CRISPR/Cas9的使用受到脱靶突变的发生的限制,脱靶突变可以在基因组的其他区域产生意想不到的遗传变化。这种现象可能是由于gRNA的非特异性设计,考虑到Cas9以序列依赖的方式容忍gRNA与目标DNA在不同位置的错配,这是一个关键的限制因素(Hsu et al., 2013)。一些工具,如cas - finder (Bae等人,2014)和VARSCOT (Wilson等人,2019b),可以帮助研究人员确定可能阻碍基因组编辑方法的潜在脱靶的位置和数量。然而,这种方法只能用于具有可用基因组信息的物种。最近,Hajiahmadi等人(2019)报道并讨论了在不使用外部诱发因素(如与温度无关的方法)或昂贵设备的情况下减少这种脱靶的各种方法。
为了改进CRISPR/Cas技术并减少限制,已经鉴定出了几种不同的Cas,它们在原间隔相邻基序(PAM)识别位点的位置和序列不同。其中,来自嗜热链球菌(St1Cas9)和金黄色葡萄球菌(SaCas9)的Cas9同源物(Steinert et al., 2015),以及在Francisella和Pretovella细菌中发现的Cas12a(以前称为Cpf1) (Zetsche et al., 2015)是最常见的。
迄今为止,通过基因编辑修改的主要性状与白化病表型有关,白化病表型被用作既定方案的概念证明,因为它可以进行早期表型筛选。植物素去饱和酶(PDS)基因已在许多物种中进行了修饰,如苹果(Nishitani et al., 2016)、梨(Charrier et al., 2019)、香蕉(Kaur et al., 2018;Naim等人,2018),葡萄(Nakajima等人,2017;Ren等人,2019)、猕猴桃(Wang等人,2018)、草莓(Wilson等人,2019a)和柑橘(Jia等人,2017a;Zhang等,2017;Zhu等人,2019)。除了白化性状外,基因编辑还被用于诱导一些果树物种对重要病原体的抗性(图2)。Erwinia amylovora是火枯病的病原体,一种威胁苹果和几种商业和观赏性蔷薇科的侵入性疾病。编辑DPM-1、DPM-2-和DPM-4基因,这些疾病特异性基因提供了对E. amylovora的易感性,允许释放苹果对该疾病的抗性基因型(Malnoy et al., 2016)。在真菌疾病的框架下,可可致病相关3 (NPR3)基因(一种抑制植物免疫系统的负调控因子)的编辑增加了植物对热带疫霉菌的抗性(Fister et al., 2018)。此外,Cas9蛋白可以被改造(Fauser et al., 2014),为此目的,已经产生了两种具有修饰核酸酶活性的不同酶:镍酶Cas9 (nCas9)和死酶Cas9 (dCas9)。nCas9在RuvC或HNH结构域之间的一个结构域缺乏核酸酶活性,只保留了切割一条链的能力,产生位点特异性的缺口(Fauser et al., 2014)。由于RuvC和HNH结构域的点突变导致dCas9失去了其核酸酶活性,从而丧失了破坏DNA的能力。通过这种方式,dCas9专门识别目标DNA,而不会诱导双链(或单链)断裂(Qi et al., 2013)。2016年,一种胞嘧啶脱氨酶与dCas9和nCas9融合产生胞嘧啶碱基编辑器(CBE),将C:G改变为T: a (Hua et al., 2019)。类似地,Gaudelli等人,2018年报道了腺嘌呤碱基编辑器(abe)将A.T转化为G.C.。通过这种方式,突变的cas碱基编辑器在目标DNA中特异性而精确地产生单个突变(碱基编辑)。碱基编辑已被应用于植物物种(图2),如西瓜(Li et al., 2017;Lu and Zhu, 2017;Ren等人,2018;Tian et al., 2018),以生产抗除草剂tribenuron的无转基因纯合子als(乙酰乳酸合成酶)突变植物(Tian et al., 2018)。除了碱基编辑,最近还综述了CRISPR/dCas9在植物中的其他应用,包括基因诱导和抑制、表观遗传变异和无dna修饰(Moradpour和Abdulah, 2020)。最近,已经开发了一种高度通用和准确的方法,可以确定特定DNA位点中是否存在新的遗传信息。这种方法是基于使用nCas9与逆转录酶合并,与主要编辑引导RNA (pegRNA)工程。与Cas9核酸酶相比,nCas9和pegRNA都可以指定目标位点并编码所需的编辑,诱导较低水平的脱靶编辑(Anzalone等人,2019)。据我们所知,启动编辑已应用于一年生作物,导致21.8%的启动编辑再生植物(Lin et al., 2020)。
水平基因转移的贡献
突变作图方法已经表明,在基因不相关的物种中,同源基因的相似突变如何对表型产生相似的影响。例如:i) PETALOSA基因在microRNA172靶位点突变后,在桃、玫瑰和石竹中诱导显性双花表型,并且通过基因组编辑已经在烟草中再现了该表型(Gattolin et al., 2020);ii) ALS基因是一种最广泛使用的除草剂的靶基因,它能抑制ALS酶。许多物种产生了由ALS序列点突变诱导的独立抗性,对酶的催化功能影响最小(Tranel和Wright, 2002)。这一知识允许通过碱基编辑复制ALS基因的点突变,以生产抗除草剂作物(Shimatani et al., 2017);iii)最后,终端花(Terminal Flower)基因家族(FT/FTL)受到了关注,其功能是指导植物从营养分生组织向花分生组织的过渡,并在许多物种中被保存下来(Pillitteri et al., 2004)。果树物种的水平基因技术转移分别导致了无标记载体的产生和基于ALS抗性和FT/FTL操作的幼期减少,这将在下一段中讨论。
无标记载体与新报告基因的开发
为了在科学上有用和相关,通过NPBTs诱导的修饰在植物中应该是永久性的。使用稳定转化子的主要限制是存在可选择标记基因(SMGs),它可以赋予对毒素(在抗生素的情况下)的抗性或可以代谢细胞生长所需的特定产物。公众不接受使用耐抗生素(即nptII)或除草剂的标记基因,因此,自2004年12月31日起,欧洲食品安全局禁止在欧洲使用耐药标记抗生素(指令2001/18/EC),与美国和其他国家形成对比。在一年生作物中,源于基因组编辑方法的“宿主”基因可以用传统的杂交方法丢弃;相反,这种方法在多年生物种中是不可能的,因为需要很长的时间,而且杂交本身不会保持无性繁殖品种的身份(Song et al., 2019a)。
为了克服与转基因生物相关的限制,人们尝试了几种策略来消除标记基因,包括使用无标记结构和重组系统来去除SMGs (Krens et al., 2015)。在第一种情况下,基因编辑可以在不稳定整合CRISPR/Cas9成分的情况下使用瞬态转化进行(Chen等人,2018),尽管由于转化植物细胞缺乏smg,识别靶向突变细胞具有挑战性(Song等人,2019a)。在这种情况下,必须生产大量的再生剂,以使大规模选择成为可能;然而,在大多数果树物种中,缺乏有效的协议是一个限制因素(Rugini et al., 2020)。在第二种方法中,标记基因被重组酶的两个识别序列包围,可以被化学(使用地塞米松)或物理(通过热休克)激活,从而允许SMGs的切除。与不需要的序列相邻的几个重组位点是可用的:cre-lox (Dale and Ow, 1991), R/Rs (Schaart et al., 2004)和FLP/FRT (Lyznik et al., 1993)。重组/切除系统已被证明可以有效生产无smg的苹果(Kost等人,2015;Krens等人,2015)、杏(Petri等人,2012)和柑橘(Zou等人,2013)。最近,Pompili等人(2020)报道了在苹果中使用CRISPR/Cas9-FLP/FRT基因编辑系统,旨在生产外源DNA残基含量低的再生植株。
另一种生产无标记植物的尝试是在柑橘(Ballester等,2008)和杏(López-Noguera等,2009)中进行的,包括使用与异戊烯基转移酶(ipt)基因相关的多自动转化(MAT)载体,由于位点特异性重组而进行阳性选择。这种方法包括去除不需要的序列,只整合有用的基因。在柑橘方面,“菠萝”甜橙植株的效率为65%;然而,由于该方法的基因型特异性,结果不适用于‘Carrizo’柠檬酸橙(Ballester et al., 2008)。
最近有人提出了一种避免外源DNA稳定整合的方法,而不是去除整合的外源DNA。因此,在一些一年生作物中,通过对目标基因和渐冻症基因进行碱基编辑,直接诱导点突变,产生了无转基因植物。后者对除草剂具有稳定的抗性,因此与未经编辑的植物相比,由选择剂进行的选择不会强加任何外源DNA的整合。这种方法仅限于点突变可复制的性状(Danilo等人,2019;Veillet等人,2019;Zhang等人,2019)。
属于MYB转录因子(TF)家族的报告基因的开发也取得了进展,特别是参与植物花青素色素沉着的激活(Elomaa et al., 2003)。特别是Kandel et al.(2016)将葡萄的VvMybA1与传统报告基因GFP和GUS进行了比较,结果表明MybA1(作为报告基因)适用于在细胞水平上评估基因表达。类似地,在柑橘中,Dutt等人(2018b)使用胚胎特异性Dc3基因启动子驱动VvMybA1,诱导基于花青素颜色的选择。
关于柑橘的最新研究
柑橘育种新技术的应用
大多数栽培柑橘品种起源于四个基本或初级物种之间的复杂混合物:citron (citrus medica)、pummelo (citrus maxima)、mandarin (citrus reticulata)和citrus micrantha (Xu et al., 2013;Velasco和Licciardello, 2014;Wu et al., 2014;Curk等人,2016;Wu等人,2018)。在初级和衍生物种(包括甜橙和柠檬)中,世界上大多数栽培的柑橘品种都来自单一祖先的体细胞突变,这些突变在不同的种植区域随着时间的推移而积累(Wu等人,2014;卡鲁索等人,2016;Curk等人,2016)。传统育种方法用于柑橘品种的遗传改良和创造新品种,或改善所需性状需要很长时间,并受到许多困难和限制,这些困难和限制与柑橘的植株大小和幼期长,以及雌性和/或雄性不育、多胚性、杂合子性和孤雌性有关。
最近,控制感兴趣性状的基因的部分可用性和知识已经放缓,探索和利用柑橘中的npbt的可能性是可行的。本文报道的基因和标记是指众所周知的特征性状,这些基因和标记的信息是在柑橘基因组可用后开发的(Xu et al., 2013;Wu et al., 2014;Curk等人,2016;Wang et al., 2017;Wu等人,2018)。迄今为止,Ruby(一种myb样TF)及其启动子3’ltr是柑橘类水果中由于花色素苷的存在而控制紫色色素沉着的主要基因之一(Butelli et al., 2012);CsLOB1(侧器官边界基因家族)和CsWRKY22是甜橙中与柑橘细菌溃疡病(CBC)易感性相关的基因(Hu et al., 2014;Wang et al., 2019);CitRWP控制甜橙、葡萄柚、柠檬和柑橘的多胚性(Wang et al., 2017);Noemi代表Myc-like,它与Ruby一起控制柑橘中的花青素色素沉着,也负责柑橘水果的无酸特性(Butelli等人,2019)。
在其他果树中,NPBTs在柑橘中的应用主要集中在抗生物胁迫的植株(品种和砧木)的生成上。因此,基因组编辑在柑橘中的成功应用首先基于CsLOB1的使用,CsLOB1是负责CBC易感性的基因(Hu et al., 2014;段等,2018)。CBC是一种严重的检疫性疾病,由柑橘黄单胞菌(Xcc)和柑橘黄单胞菌(Xca)引起,这两种细菌在全球范围内均有发现,地中海盆地除外(Gottwald等,2001年)。基因工程是诱导对CBC抗性的最佳方法(Zhang et al., 2010)。考虑到通过传统育种难以引入抗性,最近的一种方法涉及使用npbt来干预宿主-病原体相互作用的作用机制。考虑到细菌,柑橘X. citri菌株具有特定的病原体类型(PthA4, PthA*, PthAw, PthB和PthC),这些病原体类型是基于编码转录激活子样(TAL)效应子的重复可变二残基(RVDs)的保守性来区分的。它们识别易感植物基因启动子中相应的效应结合元件(EBE),如LOB和糖转运tf (Hutin et al., 2015)。对‘Duncan’葡萄柚CsLOB1启动子中的单个EBE等位基因(type 1)进行基因组编辑(Jia et al., 2016),可以产生抗突变Xcc菌株的转基因株系,但易受野生型Xcc的影响。在“邓肯”柚子和“万金城”橙子中,CsLOB1的EBEs等位基因(I型和II型)突变导致野生型Xcc感染引起的转化植物症状减轻(Jia et al., 2016;贾等,2017b;彭等人,2017)。此外,为了通过对CsLOB1启动子的CRISPR/Cas9方法提高抗性(Zhou et al., 2017),已经直接从柑橘外植体中产生纯合突变体,以降低“万金城”橙子中病原体触发免疫的标记基因CsWRKY22对CBC的敏感性(Wang et al., 2019)。此外,Cas12a的有效性已成功应用于柑橘。CRISPR/Cas12a通过xcc促进的农业浸润修饰EBEPthA4-CsLOBPs的两个等位基因来编辑邓肯葡萄柚中的CsPDS的效率已被检验。七个转化的“邓肯”植物中有一个被发现含有最高的突变率,表明降低了溃疡病易感性(Jia等人,2019年)。最近,Zhu等人(2019)使用一种野生柑橘物种Fortunella hindsii(其幼年期约为8个月,习性矮小),利用农杆菌介导的转化,观察了一项成功的CRISPR/Cas9实验的效果。合成了两种gRNAs来编辑PDS基因,五种转基因株系表现出靶向突变位点,从而产生了全局和花叶白化表型(Zhu et al., 2019)。这些结果表明,编辑或顺生诱导早花可能是加速功能基因组研究中基因表征的成功策略,特别是与生殖生物学和果实相关的性状。
与基因组编辑方法相比,同源基因改造cisgenesis在柑橘中的应用较少。这是由于技术上的困难和对特定基因及其启动子功能的有限知识。柑橘中唯一的例子涉及使用Ruby基因,该基因无内含子,带有CaMV 35S启动子和终止子(经典的内生实验),目的是生产花色素含量高的“墨西哥”酸橙(citrus aurantifolia)水果(Dutt et al., 2016)。
值得注意的是,NPBTs在柑橘中的应用严格依赖于转化过程的可用性,该转化过程需要使用可选择的标记基因,大多数情况下是nptII基因。到目前为止,还没有无标记载体用于柑橘的童颜基因改造cisgenesis和基因组编辑,这限制了将NPBTs应用于这些物种的可能性。
转化与再生:柑橘遗传改良植物育种新技术的主要瓶颈
再生和转化是分子育种和NPBTs应用的主要瓶颈,在柑橘中也是如此。农杆菌介导的幼苗组织的稳定或短暂转化是引入外源DNA的首选方法,并已在许多柑橘基因型上进行。迄今为止,转化和再生协议可用于:' Carrizo ' citrange和' Swingle ' citrumelo (Cervera et al., 1998b),这两种砧木可被视为模型植物;“菠萝”(Peña et al., 1995)、“哈姆林”和“瓦伦西亚”甜橙(Dutt and Grosser, 2010);“Femminello Siracusano”柠檬(Gentile et al., 2007);“邓肯”葡萄柚(Jia et al., 2017b);小柑橘(Cervera et al., 2008),墨西哥酸橙(Dutt et al., 2016);F. hindsii (Zhu等,2019)。然而,由于大量的重要品种属于不同的种和杂交种,特别是商业栽培品种缺乏具体的协议仍然是一个问题。
影响根孢酵母诱导的稳定转化过程的因素很多,通常包括外植体预培养、与工程菌共培养、愈伤组织诱导和再生芽的选择。再生介质中植物生长调节剂的平衡组成对于诱导转化细胞的增殖是重要的。特别是,细胞分裂素在愈伤组织诱导培养基中的存在促进了愈伤组织的形成(Guo et al., 2002;Khan et al., 2009)。再生速率与光周期密切相关(Moreira-Dias et al., 2000;Marutani-Hert et al., 2012)和需要避免使用适当的抗生素来生长非转化芽(Ballester et al., 2008;Rodríguez et al., 2008)。此外,A. tumefaciens的转化速率受外植体来源和类型以及共培养时间的条件的影响(Dutt and Grosser, 2009)。在“Tarocco”橙色组织中,发现用富含激素的液体培养基进行有限的外植体预孵育期可以提高转化效率(Peng et al., 2019)。在葡萄柚叶片中通过农杆菌浸润进行的瞬时基因表达测定表明,瞬时转化效率会受到不同因素的影响,如浸润介质、农杆菌浓度和叶片发育阶段(Figueiredo et al., 2011)。Li et al.(2017)表明,利用xccc促进的农业渗透,甜橙叶片的瞬时蛋白质表达处于最佳状态(Jia和Wang, 2014)。
还应考虑试管幼株和成熟株之间的选择,如果处理有籽或无籽果实,则必须采用不同的方法(图3)。此外,许多柑橘品种的多胚性质使珠心苗转化成为转基因植物,从而产生保持母体植物遗传背景的转基因植物。上胚轴外植体等年轻组织(Peña等,1995;Dutt and Grosser, 2009)和叶段(Khan et al., 2009;Khan et al., 2012)已被广泛应用于A. tumefaciens介导的转化中,并取得了较高的转化效率;然而,由这些组织再生的植物通常表现出较长的幼期,需要多年才能结果,从而推迟了对转化植物园艺特性的评估。
图3不同组织来源的农杆菌介导柑橘品种转化的不同方法(A)珠心苗幼节间节段。(B)从未受精的胚珠获得胚性愈伤组织。(C)成熟组织,如叶片和叶片的节间节段。从转化外植体再生中获得的所有芽或胚都嫁接到活力旺盛的砧木上,以诱导早开花,最终目的是缩短改良性状的评价。
利用成熟植株的外植体可以通过源植物材料的体外活化来克服这些限制,包括将成熟芽嫁接到幼根上(Cervera等人,1998a;Cervera等人,2008;奥博维克等人,2015);然而,柑橘和其他果树物种中成体物质的转化效率比从幼年柑橘组织中获得的转化效率低几倍(Almeida et al., 2003;He et al., 2011)依赖于基因型(表1),实验需要大量的外植体,以及可能使过程复杂化的高污染率。尽管做出了不同的努力,但成熟节间外植体的转化效率仍然很低,不超过6.1%(表1),除了' Hamlin '甜橙的转化芽率为12.8% (orboviic et al., 2015);去除芽的节点转化效率为11.7% (Peng et al., 2019),当薄片用作外植体时,在' Pera '甜橙中转化效率达到35% (Kobayashi et al., 2017)。此外,每个品种对不同再生条件的不同反应(Rodríguez et al., 2008)突出了增加柑橘再生协议数量的必要性;此外,为了成功地将转基因和npbt应用于柑橘,还需要优化商业品种的有机反应。
表1基因型表、成熟组织外植体(节间)数量及转化效率(TE%)
农杆菌介导转化的另一种替代方法是从柑橘胚性愈伤组织中悬浮培养的细胞直接转化(Li et al., 2002;杜特和格罗瑟,2010;Omar et al., 2016)和原生质体融合(Guo et al., 2005;Dutt等人,2018a;奥马尔等人,2018)。
这些替代策略可以用于转化顽固的基因型和难以转化的品种,如一些柑橘和柠檬品种(Dutt和Grosser, 2010)。
无论是原生质体还是细胞,再生的体细胞胚胎都来自一个细胞,因此很少观察到嵌合体;另一方面,这种材料需要更长的时间来恢复再生植物,这些植物将显示幼年性质(Dutt et al., 2018a)。在柑橘中,胚胎细胞培养和原生质体技术自1990年以来已被开发使用;许多体细胞杂交已经通过原生质体融合产生(Grosser和Gmitter, 1990;Grosser and Gmitter, 2011;Grosser等人,1992;Grosser et al., 2000)和转基因植物已从转化原生质体中恢复(Guo et al., 2005;Omar et al., 2007;Dutt等人,2018b;Omar等人,2018)和calli (Dutt等人,2018b)。至于NPBTs的应用,柑橘原生质体可用于直接递送纯化的CRISPR/Cas9核糖核蛋白(RNPs),用于高效的靶向诱变,就像已经在葡萄和苹果中进行的短暂细胞转化(Malnoy et al., 2016)。
诱导早花作为缩短柑桔幼龄期的策略
NPBTs在柑橘农业中的使用受到转化和再生阶段以及较长的幼龄阶段的限制的阻碍,这是柑橘和其他果树物种的特征(Hanke et al., 2007)。幼崽被采用是为了更快地达到一个临界尺寸,以便能够在环境中竞争。光合作用产物被导向树冠的生长,直到植物无法支持繁殖努力(Hackett, 2011)。在柑桔中,已有多种方法可以促进早熟开花。大量种质资源和杂交群体的可用性是珍贵材料的来源,可用于单个天然早花植物。F. hindsii是一个在系统发育上接近柑橘属的物种,特别有趣的是,它比其他常见的柑橘物种早得多(约8个月)开花(Zhu et al., 2019)。特别是,印度F. hindsii从种子到T0苗需要大约5个月,在PDS基因编辑后,再大约10个月才能获得接下来的T1代,这支持了使用印度F. hindsii进行功能研究非常有前景的证据(Zhu et al., 2019)。
在生物技术应用的框架内,除了通过嫁接传递转基因刺激的几种方法外,通过使用激活转基因表达的诱导启动子,有可能减少作用于内源性遗传开花途径的育种周期的持续时间(van noker和Gardiner, 2014)。有证据表明,开花的遗传机制在开花植物中广泛保守(Albani和Coupland, 2010;Amasino, 2010),尽管最有希望的是FT/FTL1家族,编码蛋白质作为开花的启动子或抑制因子。这些蛋白与磷脂酰乙醇胺结合蛋白高度相似。这些已被广泛用于许多木本植物,如苹果(Kotoda等人,2010)、李子(Srinivasan等人,2012)和橄榄(Cerezo等人,2014)。在柑橘中,Peña等人(2001)首次使用与开花有关的基因(APETALA和leaf)来诱导提前开花和结果。后来,Pons等人(2014)强调了早花基因的过表达作为加速评估与果实品质相关性状的工具的有用性。此外,到目前为止,嫁接对苹果珍贵花诱导的影响已被报道,其中M9砧木(一种过度表达FT基因的自发突变体)诱导幼苹果接穗提前开花(Foster et al., 2014)。在拟南芥、番茄和木薯中也报道了类似的结果(Lifschitz et al., 2006;Corbesier等人,2007;Notaguchi等人,2008;Silva Souza等人,2018)。在蓝莓中,使用转基因FT的砧木和非转基因接穗人工复制了这一现象(Song等人,2019b)。
最近,一些例子表明,基因组编辑的使用也可以解决早开花的诱导问题,例如猕猴桃(Varkonyi-Gasic等人,2019年)。在烟草中,同样的方法用于诱导提前开花和早熟花青素色素沉着(Liu等人,2019)。柑橘类尚无已发表的数据。
在植物中,病毒载体已被用于通过病毒诱导的基因沉默(VIGS)抑制内源基因和外源基因的表达(Senthil-Kumar和Mysore, 2011)。例如Velázquez等人(2016)开发的基于柑橘叶斑病毒(CLBV)的病毒载体。该载体携带来自拟南芥和柑橘的FT基因。CLBV是一种有效的工具,因为它在大多数商业品种中不会产生症状(Galipienso等人,2000年),它只感染韧皮部(Agüero等人,2013年),而且它不通过害虫传播。此外,接种的植物表现出正常的生殖生物学,产生花朵、活花粉和果实(Velázquez等,2016)。病毒载体不能整合到接种植物的基因组中,因此不会通过花粉传播(Vives et al., 2008)。携带FT基因的CLBV载体预计在感染后4个月在柑橘幼苗中开花,并在至少5年的时间内开花,这取决于基因型和季节。这种载体是一种具有巨大实际应用的生物技术工具,可以加速传统育种计划和遗传研究。
缩短幼期有助于加快柑橘植物的选择过程,在这个过程中,通过使用npbt诱导对病原体的抗性。最近,在Eremocitrus和Microcitrus spp.中发现了对HLB的新抗性来源(Ramadugu et al., 2016)。国际柑橘界的重点是鉴定可以使用顺基因方法转移的特定基因,以及鉴定需要编辑的易感基因。如果不能及时找到解决方案,世界柑橘作物就有可能失去其遗传特性。
将病毒载体与NPBTs结合使用可以大大减少评估定性性状编辑的柑橘植物所需的时间。很少有论文从定性的角度报道使用npbt来改善水果或蔬菜。该方法的主要局限性是抗氧化、营养和健康特性受多个基因控制,一般为多位点,相互协作,产生复杂,常受表观遗传控制,不易管理。根据Allan和Espley(2018)的综述,从遗传学的角度来看,myb tf已被广泛报道控制多酚和类胡萝卜素的生物合成,以及其他质量性状,如风味和质地。在番茄中,同时过表达Rosea1 (MYB)和Delila (bHLH)会产生非常高水平的花青素和紫色果实(Butelli et al., 2008)。这些工程番茄被用于小鼠喂养试验,并在Trp53 - / -敲除小鼠中显示出对癌症进展的保护作用(Butelli等人,2008年)。同样,在苹果中,MYB10过表达导致果肉中花青素大量积累,并导致小鼠炎症标志物减少(Espley et al., 2014)。在柑橘类研究中,着色的Moro果汁对肥胖小鼠的减肥效果(Titta et al., 2010)支持了对其他水果的类似观察,除此之外,Ruby基因是MYB TF,它控制柑橘类水果中的花青素着色(Butelli et al., 2012;Butelli等人,2017)。使用MYB tf来提高水果中的植物化学物质水平,使它们更健康,这为生产非转基因新作物提供了可能。在这种情况下,就有必要观察糖、微量和宏量营养素、维生素和种子的质量和数量方面的最终表型。
结束语
NPBTs是一种强大的工具,用于在不改变柑橘精英特性的情况下改善品质性状,并保护世界柑橘业免受最具侵略性和破坏性的疾病,如HLB。柑橘种及其近缘种由于其生物学复杂性,不能作为NPBTs应用的模式种;缺乏证实的数据支持这一观点。迄今为止,科学研究已使科学家能够缩小与其他木本植物相比的历史差距。尽管如此,在其他木本物种中取得的技术进步包括在葡萄中使用gRNA-Cas9/Cpf1 RNP复合物从原生质体细胞诱导植物再生(Malnoy et al., 2016),以及释放CRISPR/Cas9 RNPs来诱导苹果和葡萄原生质体中的无DNA靶向突变(Osakabe et al., 2018);这些数据也将应用于柑橘,以便建立更迅速的转化办法。特别是,基因组编辑方法可以显示其有效性,特别是对于那些下调或降低单个基因表达水平可以决定给定性状的修饰的性状。
因此,克服基因型特异性和源外植体问题、转化平台的可用性以及新载体和编辑策略的采用,可能为柑橘育种家提供可靠的工具,快速导入与果实品质和其他重要农艺性状相关的基因。
本文译自:
Front. Plant Sci., 14 August 2020 Sec. Plant Breeding
https://doi.org/10.3389/fpls.2020.01234