随着男性不育的不断深入研究，男科实验室的检测手段也变得较为丰富，除了大家熟知的精液常规，精子形态学等男性生育力检查的基本项目，还有更为深入的技术手段对精子进行更多角度的评估方案。
熟知的精液常规只是将一份精液样本送到实验室进行代表性的一系列检验操作，通过计算机辅助精子计算系统得出本次患者取到的精液样本的参数是否达标，并根据浓度和活力的异常程度分为轻中重度少精子症或弱精子症，但达标或不达标的精液常规参数对自然妊娠或者辅助生殖妊娠的结局帮助有多大，隐藏在精液参数底下到底还有哪些秘密，通过这一个检测好像是很难得到答案。
近年来，随着流式细胞术在辅助生殖领域得到大量应用，特别是对于精子功能学分析中有重要作用，通过这一技术手段实验室能帮助临床诊断和治疗决策上提供更有利于患者的依据。
流式细胞术（Flow Cytometry）是一种利用光学，流体力学，免疫学等方法综合的技术，流式细胞仪包含有流体学系统、光学系统和电子学系统。
鞘液包裹单细胞悬液，形成高速流动的单个细胞，依次通过光学系统，激光器照射依次通过的单细胞悬液，通过不同的滤光器接收不同的光。前向散射光（FCS）反应细胞大小，侧向散射光（SSC）反应细胞内部的复杂程度，结合细胞所偶联的荧光标记，从而反映出细胞的特征，最后电子学系统将光信号转化为脉冲信号，通过电脑和软件处理成我们常见的流式结果图 [1]。
流式细胞术一直在免疫学，血液，肿瘤学等疾病诊断方面起到很大的作用，那么在男性不育的精子功能检测方面，通过流式细胞仪对使用荧光染色特异性标记精子后进行大通量高效率检测。
1. 精子 DNA 碎片指数（DFI）
精子与女性的成熟卵母细胞结合，成功受精后发育成胚胎。但男性的一颗颗精子是在睾丸中通过生精细胞一步步分化成精子细胞后最终在附睾中变形成熟为精子，发育过程较为复杂，这其中每一步出现错误都会使得产生的精液中精子出现异常。
精子头部含有细胞核带有男性重要的遗传物质，由 DNA 双链结构组成，如果在发育过程中，精子由于各种原因 DNA 原有的双链双螺旋结构受损发生断裂造成了碎片化，则会导致遗传物质的缺失，那么这些碎片化的精子将会影响优质胚胎形成或者造成妊娠结局不良，从而导致不育和反复流产等。大量文献表明高碎片组临床妊娠率、受精率、种植率、优胚率低于中碎片组和低碎片组 [2]。
使用流式细胞技术检测 DFI 的原理是正常精子 DNA 紧密结合而具有抗酸性维持双链的稳定性，受损的精子形成松散染色质结构，其 DNA 在酸的作用下变性形成单链。吖啶橙与正常精子双链 DNA 结合呈绿色荧光，与单链 DNA 结合呈红或黄色荧，最后通过流式细胞仪来评价。
图 1. 左侧为低 DFI 样本，右侧为高 DFI 样本
2. 精子诱发顶体反应（AR）
精子头部除了精子核外还有一个发挥重要功能作用的就是顶体，顶体位于精子头前端是精子特有结构，内含多种水解蛋白酶。在受精过程中，精子必须完成顶体反应，释放顶体细胞溶解酶，协助精子穿入透明带与卵子结合。因此，顶体酶的释放使精子得以穿过卵透明带与卵子结合，是受精的前提。决定受精的不是精液常规看到的精子浓度、活力，更重要的是精子顶体需要能发挥功能作用，因此精子诱发顶体反应（AR）是精子功能的重要标志之一。
异硫氰酸耦联的豌豆凝集素（FITC-PSA）可以与精子顶体部位的糖蛋白结合，在 488 nm 激发光下可以发出绿色荧光。发生顶体反应的精子顶体内容物暴露，即可与 FITC-PSA 结合，发出绿色荧光。通过检测精子绿色荧光强度判断是否发生顶体反应，通过计算发出绿色荧光精子的比例判断精子顶体反应率 [3]。
3. 精子线粒体膜电位（MMP）
精子的运动装置鞭毛就是靠精子的中段部位线粒体供能，它是精子鞭毛运动功能重要的细胞器。精子细胞需要大量线粒体的供能进行游动、穿越宫颈屏障，抵达卵细胞附近，并进行顶体反应等一系列反应，最终实现精卵结合。精液常规的精子活力检测只是代表那一瞬间精子活动轨迹的能力，并将精子分为 A-D 级，但是精子跑得快不代表精子跑得远，在自然妊娠和人工授精过程中，精子在宫颈口获能，需要穿过子宫到达输卵管壶腹部与卵子结合，其路程对于精子大小而言非常遥远，需要的是精子的持续运动能力而不是瞬时运动能力，因此精子线粒体膜电位（MMP) 检测与精子活力检测的侧重点不同，不能互相替代。
实验中的染料 JC-1 是一种广泛用于检测线粒体膜电位的理想荧光探针，可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时，JC-1 聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1 不能聚集在线粒体的基质中，此时 JC-1 为单体，可以产生绿色荧光。目前通过流式细胞仪分析染色后精子细胞释放出的红绿荧光比例，红光比例越高，说明精子线粒体能量储备越充足 [4]。
图 3. 左侧为低线粒体膜电位，右侧为高线粒体膜电位
综上，这些生物学指标的出现为实验室和临床医生诊断带来了衔接的桥梁，也为男性不育的鉴别诊断带来更多工具，男性不育重来不是一个单因素的疾病，更不是报告单一两个指标就可以下诊断的疾病，作为医学工作者应该抽丝剥茧，不断探索其中发病的机制，使疾病的全貌完全显现出来。
1. 冯贺强。浅论研究流式细胞仪在免疫学研究中的应用 [J]. 中国医疗器械信息，2023,29 (9):91-94.
2. 成校，谢章平，何韶坚，胡斐，任惠。精子 DNA 碎片率与精液质量、胚胎质量的相关性研究 [J]. 生殖医学杂志，2024,33 (6):809-812.
3. 许世艳，涂文娇，朱科衡，刘瑜。精子功能指标在辅助生殖助孕方式选择中的作用 [J]. 生殖医学杂志，2021,30 (3):337-342.
4. 夏欣一，吴永明，侯保山，杨滨，潘连军，史轶超，金保方，邵永，崔英霞，黄宇烽.JC-1 单标法流式细胞术检测精子线粒体膜电位的研究 [J]. 中华男科学杂志，2008,14 (2):135-138.
