蛋白质的翻译后修饰（Post-translational modifications, PTMs）在调控细胞命运和功能中发挥着关键作用。其中，O-连接的β-N-乙酰葡萄糖胺（O-GlcNAc）修饰是一种重要的细胞内糖基化事件，由O-GlcNAc转移酶（OGT）催化，主要发生在丝氨酸或苏氨酸残基上。这种动态修饰在信号转导、基因表达、细胞器功能和系统生理学中起着重要作用。O-GlcNAc修饰的失调与多种疾病有关，如癌症、糖尿病和神经退行性疾病。
尽管O-GlcNAc修饰的重要性已得到广泛认可，但对其时空动态变化的理解仍然有限。传统的研究方法，如使用营养物质和激素增加O-GlcNAc修饰水平，以及遗传操作和小分子抑制剂，都有其局限性。这些方法往往难以精确控制O-GlcNAc修饰的时间和空间分布，从而影响对细胞内信号传导路径的深入理解。
为了解决上述问题，耶鲁大学医学院终身教授杨晓勇与新加坡分子细胞研究所首席科学家韩卫平合作开发了一种光控O-GlcNAc转移酶工具——Opto-OGT。该工具通过融合一个光敏隐花色素蛋白（CRY2）到OGT上来实现。CRY2是一种光敏蛋白，能够在蓝光照射下发生构象变化并诱导寡聚化。将CRY2融合到OGT的C端，形成OGT-mCherry-CRY2融合蛋白。在黑暗条件下，CRY2阻断了OGT的底物进入位点；在蓝光照射下，CRY2发生构象变化，释放OGT的底物进入位点，从而激活OGT。mCherry是一种荧光报告蛋白，用于标记和追踪OGT的位置和活性。
为了进一步优化和验证Opto-OGT的功能，研究人员还构建了多个变体，包括：
OGT-mCherry-CRY2low：CRY2突变体，寡聚化速率较低，用于测试不同寡聚化速率对OGT活性的影响。
OGT(K852M)-mCherry-CRY2：催化失活的OGT突变体，用于验证催化域在Opto-OGT中的作用。
sOGT-mCherry-CRY2：截短的OGT变体，用于验证四肽重复序列（TPR，参与OGT的多聚化和底物识别）在Opto-OGT中的作用。
CRY2-mCherry-Flag-OGT：改变融合顺序，用于评估不同排列对Opto-OGT活性的影响。
在HEK293T细胞中，15分钟的Opto-OGT激活导致AMPK O-GlcNAc化增加，S6和mTOR磷酸化逐渐增强，而AMPK磷酸化保持不变，模拟了从0 mM到25 mM葡萄糖浓度变化的效果。长时间（1小时）激活则显示出相反的信号模式，表明OGT不仅作为葡萄糖传感器，还可能感知营养缺乏和应激。
通过将CIB1的N端截短形式（CIBN）与特定的细胞定位标记（如线粒体外膜的miro蛋白和细胞膜的CAAX基序）融合，实现了OGT在不同亚细胞区域的特异性激活。结果表明，线粒体特异性激活Opto-OGT显著提高了线粒体内的O-GlcNAc水平，而细胞膜特异性激活则下调了胰岛素刺激下的AKT磷酸化和信号输出。
Opto-OGT作为一种光控O-GlcNAc转移酶工具，能够实现对O-GlcNAc修饰的精确时空控制。该工具不仅有助于深入理解O-GlcNAc修饰在细胞信号传导和生理功能中的作用，还为开发针对相关疾病的治疗策略提供了新的思路。未来的研究将进一步探索Opto-OGT在不同细胞类型和组织中的应用，以及与其他光控工具的组合使用，以揭示更复杂的细胞内信号网络。
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41589-024-01770-7
