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知识点1 — 交替催化生物异质结构酶
1、定义
交替催化生物异质结构酶（AC-BioHJzymE）是一种新型的生物催化剂，它结合了不同金属中心和酶的特性，以实现高效和选择性的催化反应。这种材料通常由金属硫化物和其他具有催化活性的生物分子组成，它们共同形成一个具有交替催化能力的复合体。在文章中提到的CuFe2S3@LOD就是一个例子，它由CuFe2S3和乳酸氧化酶（LOD）组成，能够在近红外光的激活下展现催化活性。
2、应用
抗菌治疗：AC-BioHJzyme能够模拟天然酶的活性，产生具有抗菌能力的活性氧物质（如羟基自由基），在医疗领域，特别是治疗感染性伤口方面具有潜在的应用价值。
伤口愈合：通过促进胶原蛋白沉积和血管生成，AC-BioHJzyme有助于加速伤口的再生过程。
药物递送：由于其催化和响应特性，AC-BioHJzyme可以作为药物递送系统，实现药物在特定条件下的可控释放。
环境治理：在环境领域，AC-BioHJzyme可以用于污染物的降解，利用其催化能力将有害物质转化为无害物质。
3、优点
① 高效催化：AC-BioHJzyme的交替催化机制可以提高催化效率，实现更快的反应速率。
② 选择性：通过精确设计金属中心和酶的组合，AC-BioHJzyme可以对特定的底物或反应途径表现出高度的选择性。
③ 光响应性：AC-BioHJzyme通常具有光响应性，可以在光照条件下激活，为控制催化反应提供了一种非侵入性的方法。
④ 生物相容性：由于其生物分子的组成，AC-BioHJzyme在生物体系中通常具有良好的相容性，减少了潜在的免疫反应或毒性问题。
⑤ 多功能性：AC-BioHJzyme可以集成多种功能，如抗菌、促进组织再生和药物递送，使其成为一种多用途的平台技术。
⑥ 环境友好：在环境治理中，AC-BioHJzyme作为一种绿色催化剂，有助于减少化学处理过程中的环境污染。
知识点2 — 近红外二区光激活
1、定义与原理
近红外二区（NIR-II）光激活是一种先进的技术，它利用近红外光谱的特定波段（通常指1000至1700 nm）来激发材料产生特定的生物效应或化学反应。NIR-II光位于近红外光谱的远端，具有较深的组织穿透能力和较低的光吸收率，这使得它在生物医学领域，尤其是光疗和成像方面具有独特的优势。NIR-II光激活通常涉及使用这种特定波长的光来激发材料中的光敏剂或纳米结构，从而引发一系列光化学或光物理过程。
2、应用
① 光热效应：CuFe2S3@LOD在NIR-II光照射下能够产生光热效应，提高局部温度，有助于促进伤口愈合和增强抗菌效果。
② 光动力治疗（PDT）：通过NIR-II光激活光敏剂产生活性氧物质，用于治疗癌症或感染性疾病。
③ 光化学激活：NIR-II光能够激活AC-BioHJzyme中的酶活性，增强其催化产生羟基自由基等活性氧物质的能力，从而提高抗菌效果
④ 生物成像：由于NIR-II光的深组织穿透能力，它可以用于高分辨率的生物体内成像。
3、优点
① 深层组织穿透：NIR-II光能够深入生物组织，实现深层结构的成像和治疗。
② 最小化组织损伤：相比于可见光或紫外光，NIR-II光对生物组织的损伤较小。
③ 高对比度成像：NIR-II光激活的成像技术能够提供高对比度的图像，有助于更精确的诊断。
④ 低背景信号：由于生物组织对NIR-II光的吸收较低，可以实现低背景噪声的成像。
⑤ 可控性：通过调节光的强度和时间，可以控制光激活反应的程度，实现对治疗效果的精确控制。
NIR-II光激活技术在CuFe2S3@LOD中的应用展示了其在生物医学领域的巨大潜力，特别是在促进感染性伤口愈合方面。通过精确的光控，可以实现对治疗效果的优化和最大化。
知识点3 — 拟酶活性
1、定义
拟酶活性（Enzyme-mimetic activity），也称为模拟酶活性，指的是一种材料或分子能够模仿天然酶的催化功能，催化特定的化学反应。这种活性在生物材料、纳米技术和医药领域具有重要的应用价值。拟酶活性涉及到非酶材料（如金属纳米粒子、金属有机框架、某些聚合物等）能够催化反应，这些反应通常由生物体内的酶来执行。这些材料通过模拟酶的活性位点，能够催化底物分子发生氧化还原反应或其他类型的化学反应。
2、优点
① 稳定性：相比于生物酶，拟酶活性材料通常具有更好的稳定性和更长的使用寿命。
② 易于修饰：可以通过化学方法对材料表面进行修饰，以优化其催化性能。
③ 多功能性：可以设计具有多种拟酶活性的材料，实现多种催化反应。
④ 生物相容性：某些拟酶活性材料具有良好的生物相容性，适合在生物体内使用。
3、应用
CuFe2S3@LOD具有以下三种拟酶活性，因而能够成为一种有效的抗菌材料，并且能够促进感染性伤口的全阶段再生。通过模拟天然酶的催化机制，CuFe2S3@LOD在抗菌和伤口愈合方面展现出了巨大的应用潜力。
① 谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）模拟活性：通过消耗谷胱甘肽（GS（H）阻断细菌的抗氧化系统。
方法：将50 μL样品溶液和450 μL GSH溶液溶解在碳酸盐缓冲液（pH = 8.0）中。孵育和NIR 10 min后，加入450 μL TRIS-HCl缓冲液和100 μL DTNB 混合用紫外-可见光谱法在410 nm处测定上清液的吸光度。
② 过氧化物酶（POD）模拟活性：能够催化H2O2产生•OH，具有抗菌作用。
方法：采用MB实验测定NIR照射下的OH浓度。将样品（1 mg/mL）和过氧化氢（100 μL）加入到MB溶液（400 μL，80 mg/L）中。NIR-II照射10 min后，在550~750 nm处测量紫外-可见吸光度。另外，采用TMB法测定OH。在500~800 nm处检测溶液的紫外-可见吸光度。
③ 过氧化氢酶（CAT）模拟活性：能够将H2O2分解为O2，进一步在NIR-II光照射下产生单线态氧（1O2）和•O2−。
方法：使用溶解氧仪监测O2浓度。CuFe2S3（1 mg/mL）与过氧化氢（20 μL，10%）孵育。每30秒加入过氧化氢（20 μL，10%），监测O2产量。以DPBF作为1O2捕获剂检测产品 在NIR-II下的1O2上。将600 μL的样品（1 mg/mL）分散在600 μL的DPBF溶液中，孵育30 min。用紫外分光光度法测定上清液的OD值。
在深度感染性伤口中，由于病原体感染引起的巨噬细胞表型紊乱和乳酸的积累，导致伤口再生停滞。基于此，四川大学邓怡研究员和杨为中教授团队开发了一种由CuFe2S3和乳酸氧化酶（LOD）组成的AC-BioHJzyme，该物质能够在近红外二区（NIR-II）光的激活下，展现出循环拟酶抗菌（EMA）活性和巨噬细胞重编程能力。LOD能够消耗细菌厌氧呼吸产生的乳酸，生成过氧化氢（H2O2），为CuFe2S3的酶模拟活性提供底物，进而转化为具有杀菌作用的羟基自由基（•OH）。AC-BioHJzyme具有GPx模拟活性，能够消耗谷胱甘肽，阻断细菌代谢中的抗氧化系统。在NIR-II光照射下，CAT模拟活性产生的氧气（O2）能够生成单线态氧（1O2）。CuFe2S3@LOD在感染性微环境中释放的H2S气体能够促进Fe（III）/Cu（II）到Fe（II）/Cu（I）的价态转换，从而维持持续的EMA活性。实验表明CuFe2S3@LOD能够显著促进感染性皮肤再生，通过杀死细菌、促进上皮形成/胶原蛋白沉积、促进血管生成和重新编程巨噬细胞。
本研究提供了一种通过循环酶模拟抗菌和巨噬细胞重利用来促进深度感染性伤口愈合的对策。这项研究的重点在于开发了一种新型的生物材料，用于有效治疗深度感染性伤口，通过促进伤口的抗菌和再生过程，具有潜在的临床应用价值。
（A） SEM图像：展示了FeS、CuFe2S3和CuFe2S3@LOD的扫描电子显微镜（SEM）图像。其中FeS呈现为薄刀片状形态，尺寸约为8μm。CuFe2S3展示出片状结构，尺寸约为250 nm。CuFe2S3@LOD图像中可以看到有机LOD颗粒分布在CuFe2S3片状结构上。（B） HR-TEM图像：高分辨透射电子显微镜（HR-TEM）图像揭示了CuFe2S3的晶格条纹。测量得到的晶面间距为3.00和3.21埃，分别对应CuFe2S3的（210）和（031）晶面。（C） TEM和EDS映射：透射电子显微镜（TEM）图像和能量色散X射线光谱（EDS）映射显示了Cu、Fe、S和N在样品中的均匀分布。这表明CuFe2S3成功合成，并且LOD成功负载在CuFe2S3上。（D、E）XRD图谱：X射线衍射（XRD）分析显示了FeS和CuFe2S3的特征峰。这些峰对应于FeS和CuFe2S3的标准卡片，证实了样品的晶体结构。（F）FTIR光谱：傅里叶变换红外光谱（FTIR）展示了CuFe2S3、LOD和CuFe2S3@LOD的化学键特征。LOD的特征峰表明LOD成功整合到了CuFe2S3@LOD结构中。（G-I） XPS光谱：X射线光电子能谱（XPS）分析显示了CuFe2S3@LOD中Cu、Fe、S、N、O和C的存在。Fe 2p和Cu 2p的高分辨率XPS光谱表明Cu和Fe以不同的价态存在，这可能增强EMA活性。
（A） DTNB机制：5,5'-二硫代-双硝基苯酸（DTNB）用于检测谷胱甘肽（GSH）的消耗。该机制展示了GPx模拟活性，即样品在光照下生成活性氧（ROS）的能力。（B） DTNB颜色变化和吸光度：CuFe2S3@LOD在光照下显示出显著的GSH消耗，表明其具有高效的GPx模拟活性。（C） DPBF机制：1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）用于检测单线态氧（1O2）和超氧阴离子（•O2−）。该机制说明了样品在光照下产生这些活性氧种的能力。（D） O2释放：使用溶解氧计测量CuFe2S3在H2O2环境中的CAT模拟活性。样品能够将H2O2分解为O2，显示出良好的CAT模拟活性。（E-F）DPBF和DHE光谱：DPBF光谱显示CuFe2S3@LOD在NIR-II照射下产生1O2和•O2−。DHE光谱用于检测超氧阴离子（•O2−），其荧光强度与•O2−含量正相关。（G）ESR光谱：电子自旋共振（ESR）光谱确认了CuFe2S3@LOD在NIR-II照射下产生1O2。（H）H2S释放：在酸性环境中，CuFe2S3@LOD释放H2S，且释放量与样品浓度正相关。（I）温度曲线：不同浓度的CuFe2S3@LOD在NIR-II激光照射下的温度曲线，显示了材料的光热效应。（J）光热循环曲线：展示了CuFe2S3@LOD在多次NIR-II照射下的光热稳定性。（K）带猪皮的温度曲线：即使在3 mm厚的猪皮下，CuFe2S3@LOD也显示出良好的光热性能。
（A）四甲基联苯胺（TMB）吸光度：利用TMB作为底物，通过其被氧化成氧化态TMB（ox-TMB）的吸光度变化，评估了样品的过氧化物酶（PO（D）模拟活性。在存在H2O2时，CuFe2S3能够催化H2O2产生羟基自由基（•OH），这一点通过TMB吸光度的特定峰值变化得到证实。（B）亚甲基蓝（MB）吸光度：使用MB进一步验证POD模拟活性。MB与•OH反应后，其吸光度强度降低。CuFe2S3@LOD在乳酸（LA）和H2O2共存时显示出最强的吸光度峰，表明LOD催化增强了H2O2的产生，从而增加了•OH的生成。（C） DMPO检测的•OH的电子自旋共振（ESR）光谱： ESR光谱使用5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）作为自旋捕获剂，检测CuFe2S3@LOD产生的•OH。随时间增加，CuFe2S3@LOD产生的•OH量增多，这一点从ESR信号的强度中得到体现。（D）Km、Vmax和TON：展示了CuFe2S3@LOD作为AC-BioHJzyme的Michaelis常数（Km）、最大初速度（Vmax）和周转数（TON），这些参数体现了其催化能力。（E） TON值比较：将CuFe2S3@LOD的TON与其他POD模拟系统进行比较，显示了CuFe2S3@LOD具有显著更高的催化效率。（F-H）反应路径和交替催化机制：通过DFT计算，模拟了H2O2在CuFe2S3@LOD表面的吸附路径和反应机制。展示了Fe（III）和Cu（II）与H2O2反应生成•OH的可能路径，以及Cu和Fe如何通过交替催化增强•OH的产生。
（A-D）菌落计数板和细菌计数：展示了CuFe2S3@LOD在NIR-II光照射下对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）的抗菌效果。通过平板计数法测定了不同样品处理后的细菌存活情况，CuFe2S3@LOD显示出极高的杀菌率，接近99.99%。（E）SEM图像：通过扫描电子显微镜（SEM）观察了经CuFe2S3@LOD处理和NIR-II照射后的细菌形态。与磷酸盐缓冲液（PBS）处理的对照组相比，CuFe2S3@LOD处理的细菌显示出明显的形态损伤和细胞膜破裂。（F）TEM图像：透射电子显微镜（TEM）图像进一步展示了CuFe2S3@LOD处理和NIR-II照射对细菌结构的影响。细胞膜变得模糊，细胞质泄漏，细胞器结构受损，DNA不可见，这些变化证实了CuFe2S3@LOD的抗菌效果。（G）活细胞/死细胞染色：使用活细胞/死细胞染色法对E. coli进行了存活性分析。在CuFe2S3@LOD和NIR-II照射下，大多数细菌被标记为红色（死亡细胞），而PBS处理组中的细菌保持绿色（活细胞）。（H）抗菌机制图：总结了基于实验结果的抗菌机制，包括细胞膜损伤、蛋白质变性、热效应、1O2/•O2−和•OH的产生。
（A）PCA分析：主成分分析（PCA）图显示了CuFe2S3、CuFe2S3@LOD和CuFe2S3@LOD+NIR组与未处理对照组之间的差异。PCA结果表明，经过CuFe2S3@LOD处理的细菌在基因表达层面上发生了显著变化，尤其是经过NIR-II照射的样品。（B）火山图：火山图展示了不同样品处理后细菌基因表达的差异，包括上调（红色）和下调（绿色）的基因。火山图上的点表示基因表达变化的幅度和统计显著性，有助于识别受到CuFe2S3@LOD处理影响的关键基因。（C-E）京都百科全书基因和基因组（KEGG）富集分析：揭示了CuFe2S3@LOD处理对细菌代谢途径的影响。通过比较CuFe2S3组、CuFe2S3@LOD组和CuFe2S3@LOD+NIR组与对照组，识别了受调控的代谢途径。（F）基因本体（GO）富集分析：展示了CuFe2S3@LOD处理影响的生物过程、细胞组分和分子功能。GO分析提供了关于基因表达变化如何影响细菌生物学的详细信息。（G）激活途径分析：该分析进一步细化了基因表达变化所影响的特定生物途径，如代谢途径、能量代谢、遗传信息处理等。（H）抗菌机制图：总结了CuFe2S3@LOD AC-BioHJzyme在有无NIR-II照射下的抗菌机制。机制图可能包括了ROS产生、细胞膜损伤、代谢途径干扰等多种因素的综合作用。
（A）抗生物膜形成过程示意图：描述了生物膜的形成过程以及如何通过实验方法评估抗生物膜活性。（B、C）结晶紫染色和定量分析：结晶紫染色用于评估细菌生物膜的形成情况。图B展示了不同样品处理后生物膜的染色情况，而图C通过定量分析显示了生物膜量的变化。CuFe2S3@LOD+组在NIR-II照射下显示出较强的抗生物膜效果，表现为染色强度的降低。（D）定量分析：对结晶紫染色结果的定量分析进一步证实了CuFe2S3@LOD在抑制生物膜形成方面的效果。（E-G）细胞内ROS水平检测：使用DCFH-DA作为荧光探针，通过荧光显微镜观察和定量分析了不同样品处理后细菌内部活性氧（ROS）的水平。CuFe2S3@LOD+组显示出最高的ROS水平，表明其在NIR-II照射下能够显著增加细菌内部的ROS积累。
（A、B） CCK-8实验：使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）对小鼠上皮样成纤维细胞（L929）和人永生化表皮细胞（HaCaT）进行了细胞活性测试。测试结果通过450 nm处的吸光度表示，反映了不同样品处理下细胞的存活率。（C） CLSM图像、活死染色和SEM图像：共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像、活细胞/死细胞染色和扫描电子显微镜（SEM）图像显示了细胞与不同样品共培养后的形态。CuFe2S3@LOD处理的HaCaT细胞表现出明显的伪足，表明良好的细胞相容性。（D）流式细胞术图像：流式细胞术用于分析巨噬细胞的极化状态，特别是M2型巨噬细胞的比例。F4/80和CD206作为标记物，用于区分和定量M2型巨噬细胞。（E） qPCR分析：定量逆转录聚合酶链反应（qPCR）用于分析M1型和M2型巨噬细胞标记物的表达水平。选择了肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）作为M1型标记物，白介素-10（IL-10）和精氨酸酶-1（ARG1）作为M2型标记物。实验结果表明，CuFe2S3@LOD对L929细胞和HaCaT细胞表现出良好的细胞相容性，没有明显的细胞毒性。此外，CuFe2S3@LOD能够促进M2型巨噬细胞的极化，这可能有助于调节炎症反应并促进组织修复。qPCR分析进一步证实了CuFe2S3@LOD对巨噬细胞极化状态的调节作用。
（A） PCA分析：显示了不同处理条件下RAW264.7细胞的基因表达差异。（B）火山图：火山图展示了基因表达变化的幅度和统计显著性，用以识别受CuFe2S3处理影响的关键基因。（C-E） GO富集分析：揭示了CuFe2S3处理对RAW264.7细胞中基因功能的影响。分析了CuFe2S3与对照组、CuFe2S3+与对照组、CuFe2S3+与CuFe2S3之间的差异表达基因。（F-H） KEGG富集分析：展示了不同处理条件下的代谢途径变化。分析了CuFe2S3与对照组、CuFe2S3+与对照组、CuFe2S3+与CuFe2S3之间的差异。（I）蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图：展示了由基因表达变化所影响的蛋白质之间的相互作用网络。结果显示，通过RNA测序分析，提供了CuFe2S3对RAW264.7细胞基因表达影响的全面视图。PCA和火山图揭示了基因表达的全局变化，而GO和KEGG富集分析则深入到了具体的生物学过程和代谢途径。PPI网络图进一步展示了基因表达变化如何影响细胞内的信号传导和功能网络。这些结果有助于理解CuFe2S3@LOD在免疫调节和细胞功能中的潜在作用机制。
（A）实验设计示意图：描述了在小鼠身上创建全层皮肤伤口并感染金黄色葡萄球菌（S. aureus）的过程。展示了不同样品如何应用于伤口以及NIR-II照射是如何进行的。（B）实时红外热图像：展示了不同样品在体内NIR-II照射下的光热效应。CuFe2S3@LOD组在照射下迅速升温，显示出良好的光热性能。（C）伤口愈合面积和照片：记录了不同时间点（0、1、3、5天）的伤口愈合情况，并通过照片直观展示了愈合过程。CuFe2S3@LOD+组（NIR-II照射）显示出更快的伤口闭合速度。（D）伤口愈合面积的定量分析：通过定量分析，进一步确认了CuFe2S3@LOD+组在伤口愈合方面的优越性能。（E）H&E染色和Masson染色：通过组织化学染色评估了伤口愈合过程中的细胞浸润和胶原蛋白沉积。H&E染色显示CuFe2S3@LOD+组的炎症细胞较少，Masson染色显示更多的胶原蛋白沉积。（F）H&E染色的定量分析：对H&E染色中的中性粒细胞区域进行了定量，以评估炎症反应的程度。（G）Masson染色的定量分析：对Masson染色中的胶原蛋白沉积进行了定量，以评估组织修复的进展。
（A）革兰氏染色和免疫组化染色：革兰氏染色用于检测伤口组织中的细菌残留。免疫组化染色检测了CD31、VEGF、TNF-α和IL-10的表达，以评估血管生成、炎症反应和免疫调节。（B）细菌计数：对革兰氏染色中的细菌进行了定量分析，以评估不同样品的抗菌效果。（C）CD31阳性细胞百分比：通过免疫组化染色评估了CD31阳性的血管内皮细胞，以定量分析新生血管的形成。（D）VEGF阳性面积：通过荧光染色定量了VEGF的表达，反映了伤口愈合过程中血管生成的程度。（E）TNF-α阳性细胞百分比：通过免疫组化染色评估了促炎细胞因子TNF-α的表达，以了解炎症反应的情况。（F）IL-10阳性细胞百分比：通过免疫组化染色评估了抗炎细胞因子IL-10的表达，以了解免疫调节的情况。（G）雷达图：雷达图综合比较了不同样品处理组在胶原蛋白沉积、VEGF表达、IL-10表达、抗菌率和细菌计数方面的效果。（H）愈合机制图：总结了CuFe2S3@LOD促进伤口愈合的机制，包括抗菌、抗炎、促进胶原蛋白沉积和血管生成等。
综上所述，在这项研究中发现，一种新型的氢硫化物（H2S）释放的交替催化生物异质结构酶（AC-BioHJzym（E），即CuFe2S3@LOD，用于全阶段感染性伤口的再生。CuFe2S3@LOD通过水热法合成，结合了CuFe2S3和乳酸氧化酶（LOD），旨在解决深度感染性伤口中的巨噬细胞表型失调和由病原体感染引起的高度酸性细菌微环境问题。通过SEM、TEM、EDS、XRD、FTIR和XPS等技术对CuFe2S3@LOD的形态、尺寸、元素分布和化学组成进行了详细表征。CuFe2S3@LOD展现出显著的体外抗菌效果，能够高效杀死金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli，并且其抗菌效果可通过NIR-II光照射进一步增强。CuFe2S3@LOD具有模拟多种酶（GPx、CAT、POD）的活性，能够产生活性氧（ROS），包括羟基自由基（•OH）、单线态氧（1O2）和超氧阴离子（•O2−）。CuFe2S3@LOD在NIR-II光照射下显示出良好的光热性能，能够迅速升温，有助于抗菌和促进伤口愈合。在动物模型中，CuFe2S3@LOD证实了其体内抗菌效果和促进伤口愈合的能力，通过减少炎症、促进胶原蛋白沉积、血管生成和巨噬细胞重编程来加速皮肤再生。CuFe2S3@LOD对正常细胞显示出良好的生物相容性，并通过调节巨噬细胞的极化状态来促进伤口愈合过程。通过细菌转录组测序，分析了CuFe2S3@LOD对细菌基因表达的影响，揭示了其抗菌机制。同时，通过免疫组化和荧光染色，研究了CuFe2S3@LOD在体内伤口愈合中的作用机制。CuFe2S3@LOD作为一种新型的抗菌和伤口愈合促进剂，通过其酶模拟活性、光热效应和对宿主细胞的调节作用，为深度感染性伤口的治疗提供了一种有效的策略。文章的研究结果不仅为理解CuFe2S3@LOD的抗菌和伤口愈合机制提供了深入的见解，而且展示了其在临床治疗深度感染性伤口中的潜在应用前景。
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