干湿结合：单细胞和空间转录组分析确定转录因子 BHLHE40 作为转移性结直肠癌中 EMT 的驱动因素
结直肠癌（CRC）是人类最常见的恶性肿瘤之一，其中肝转移是死亡的主要原因。上皮间质转化 (EMT)过程赋予癌细胞增强的转移潜力。为了阐明CRC中驱动EMT的细胞机制，南京医科大学第一附属医院团队通过单细胞和空间转录组技术确定了BHLHE40是调节 EMT 的关键转录因子，可促进 CRC 肝转移。
一．通过CNV鉴定高质量恶性上皮细胞（EPC）
单细胞注释的UMAP显示，大多数细胞是免疫细胞，而较小比例包括 EPC（上皮细胞） 和 CAF（肿瘤成纤维细胞），而内皮细胞是肿瘤内最丰富的细胞类型。与TnM（非转移性原发肿瘤）相比，TM（转移性原发肿瘤）的CNV得分更高。
图1 通过CNV评分推断恶性肿瘤上皮细胞
二．CAF 和恶性 EPC 的表征
为了表征不同转移状态下 CAF 和恶性 EPC 的变化，分别对这两种细胞类型进行了亚聚类。TnM 和 TM 之间显示出两组均有不同的细胞组成。通过整合了所有CAF和恶性EPC，发现一些恶性EPC在UMAP空间中与CAF相邻，这表明这些细胞在发育上相关。与 TnM 相比，TM 在黑色框架中表现出 EPC 减少和 CAF 增加的趋势。与 TnM 相比，TM 中SFRP2+ CAF 和 CXCL1+ CAF 的比例显着增加，而 CXCL14+ CAF 和 CCL11+ CAF 的比例显着下降。TnM和TM之间细胞组成的改变可能是由这两种肿瘤类型之间不同的突变模式引起的。
图2 CAF 和恶性 EPC 的亚型
三．细胞命运推断确定了从恶性EPC_8 到 CXCL1+ CAF 和 SFRP2+ CAF 的 EMT
通路富集结果表明恶性 EPC_8、CXCL1+ CAF 和 SFRP2+ 388 CAF 中信号富集的相似模式，表明它们之间存在很强的发育相关性。RNA 速度流分析显示从恶性 EPCs_8 开始，流向 CXCL1+ CAF，最后在 SFRP2+ CAF 中结束，表明存在 EMT 过程。
图3 具有高转移潜力的 CAF 和恶性 EPC 亚型
四．细胞通讯分析确定了驱动TGF-β信号诱导EMT的TGFB1-TGFBR1/2-BHLHE40轴
CellChat 细胞间通讯分析揭示，与TnM相比，TM表现出更多的TGF-β信号传导途径。为了识别恶性EPCs_8中TGFB1-TGFBR1/2下游的靶基因，对RNA速度驱动基因、前30个高度特异性的TF和前20个下游靶基因取交集仅鉴定出一种基因，BHLHE40。与 TnM 相比，TM 中BHLHE40 显着上调。
图4. CAF 和恶性 EPC 的细胞间通讯
五．空间分析和轨迹推断验证了从恶性 EPC_8 到 CXCL1+ CAF 的EMT过程
为了进一步评估恶性 EPCs_8、CXCL1+ CAF 和 SFRP2+ CAF 的空间组结构，作者分析了 2 名发生肝转移的原发性 CRC 患者的 ST 数据，阐述细胞空间分布，并通过 PST 计算转录状态，推断它们的空间轨迹，验证恶性EPCs_8到CXCL1+CAF的EMT过程。Monocle2 构建 ST 数据的伪时间轨迹得出，早期分化状态的恶性EPCs_8发展为处于晚期分化状态的CXCL1+ CAFs 和SFRP2+ CAFs。通过分析BHLHE40表达水平随伪时间的变化，发现恶性EPCs_8在早期分化状态（伪时间较低）BHLHE40的相对表达量较高，而随着分化（假时间增加）逐渐下降。相反，对于CXCL1 + CAF，BHLHE40在早期分化状态下较低，并随着分化的进展而上调，表明BHLHE40可以促进恶性EPC_8 进行EMT转化成CXCL1 + CAF。
图5 恶性 EPCs_8 和 CXCL1+ CAF 的空间转录组和空间轨迹
六．BHLHE40与CRC的肿瘤发生和转移相关
组织微阵列的IHC分析，与正常结肠相比，BHLHE40 在 CRC 组织中显着上调。CRC的进展（I期到III期）和转移（IV期）中间BHLHE40表达增加。与 BHLHE40低表达的患者相比，BHLHE40 501 高表达的患者生存率较差。这些结果表明BHLHE40与CRC的肿瘤发生和转移相关。
图6. BHLHE40与CRC的肿瘤发生和转移相关
七．BHLHE40通过EMT促进CRC的肿瘤发生和转移
BHLHE40 OE增强了结肠癌细胞系DLD-1和HCT116细胞中的细胞迁移和侵袭能力，而BHLHE40 KD则抑制了SW480和LoVo细胞中的细胞迁移和侵袭能力。移植瘤实验发现BHLHE40 OE促进肿瘤生长，与对照相比，BHLHE40 OE 组中存在更多的 MKI67 细胞。在EMT过程中，上皮标志物E-钙粘蛋白（CDH1）下调，同时N-钙粘蛋白（CDH2）和成纤维细胞标志物波形蛋白（VIM）上调，这点在体外实验得到证实，结果表明BHLHE40促进CRC中的EMT。
图7 BHLHE40在体外和体内促进CRC细胞的增殖、EMT和转移
八．BHLHE40 是 TGF-β信号调节 EMT 中的重要 TF
为了研究 BHLHE40 如何在 TGF-β 信号传导中发挥作用，利用 TGF-β 重组蛋白或 TGFB1/2抑制剂LY2109761，用于评估CRC的肿瘤发生和转移。结果表明BHLHE40 是 TGF-β 信号传导中调节 EMT 的重要转录因子。
这篇文章总体上是一个非常好的干湿结合的案例，利用现有数据库的案例筛选出关键转录因子，主题围绕EMT出发，细胞分析围绕EMT的上皮和CAF细胞类型，加上一些功能实验，这是小编目前觉得比较完整又有内容的一篇代表性文章。
