微卫星稳定/错配修复完整型结直肠癌的免疫联合治疗进展

张晓玲, 范文轩, 杜云毅, 等. 微卫星稳定/错配修复完整型结直肠癌的免疫联合治疗进展[J]. 中华肿瘤杂志, 2024, 46(8):725-736. DOI:10.3760/cma.j.cn112152-20230904-00116.

 摘   要 

近年来，免疫检查点抑制剂（ICIs）在恶性实体肿瘤中应用广泛且疗效显著。然而，在结直肠癌（CRC）中，ICIs仅对占少数的微卫星高度不稳定/错配修复缺失型转移性CRC表现出显著的治疗效果，而占大多数的微卫星稳定（MSS）/错配修复完整（pMMR）型转移性CRC几乎不能从ICIs单药治疗中获益，免疫联合治疗成为破解这一临床难题的关键。文章介绍了MSS/pMMR型CRC免疫联合治疗的常见模式和可能机制，总结归纳了MSS/pMMR型CRC免疫联合治疗方面所做的探索和取得的进展以及免疫治疗疗效的可能预测标志物，对ICIs在MSS/pMMR型CRC治疗中的应用前景进行了展望。

【关键词】结直肠肿瘤；免疫检查点抑制剂；微卫星稳定；错配修复完整；免疫治疗

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，其分子亚型的研究近年来受到广泛关注。在临床上，免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）对微卫星高度不稳定（high microsatellite instable, MSI-H）/错配修复缺失（mismatch repair deficient, dMMR）的转移性CRC表现出显著的效果。此类肿瘤的特征是高肿瘤突变负荷（tumor mutation burden, TMB），这导致了炎症性肿瘤微环境，这种微环境中含有浸润性淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte, TIL），特别是记忆细胞和细胞毒性T淋巴细胞。但在转移性CRC患者中，微卫星稳定（microsatellite stable, MSS）/错配修复完整（mismatch repair proficient, pMMR）型占大多数，ICIs对此类肿瘤却并未显示出明显效果。因此，MSS/pMMR型CRC被认为是一种“冷”肿瘤，对晚期CRC的免疫治疗形成了巨大的挑战，需要找到方法来调节肿瘤微环境，将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤，这将是克服晚期CRC免疫治疗难题的关键。

MSS型CRC患者几乎不能从ICIs单药治疗中获益。KEYNOTE-016研究结果显示，10例dMMR型CRC患者的免疫相关客观应答率和免疫相关无进展生存率分别为40%（4/10）和78%（7/9），而18例MSS型CRC患者的免疫相关客观应答率和免疫相关无进展生存率分别为0（0/18）和11%（2/18）。KEYNOTE-028研究结果显示，23例程序性死亡蛋白配体1（programmed death-ligand 1, PD-L1）阳性（PD-L1≥1%）的CRC患者中，仅1例MSI-H同时合并有v-raf鼠类肉瘤病毒癌基因同源体B（vrafmurine sarcoma viral oncegene homolog B, BRAF）V600E突变的患者观察到了免疫应答，其他22例MSS患者均未见免疫治疗获益。但部分MSS/pMMR型CRC患者能从免疫联合治疗中获益。多种肿瘤细胞内在微环境因素介导的MSS/pMMR型CRC对ICIs存在抵抗及耐药，因此调节这种免疫抑制环境是免疫联合治疗模式的主要目标。常见的免疫联合治疗方式有免疫联合化疗、免疫联合放疗、免疫联合靶向治疗和双免疫联合治疗等。

ICIs联合化疗已成为许多实体瘤的一线标准治疗方法。免疫治疗和化疗之间相辅相成，可能的机制包括协同作用、抑制作用降低、免疫细胞增加及免疫记忆形成。目前，也有免疫联合化疗治疗MSS/pMMR型CRC的临床试验正在进行，但现有的数据未能达到预期的水平。

KEYNOTE-651研究是一项开放标签的多中心非随机Ⅰb期研究，评估帕博利珠单抗联合mFOLFO7方案（奥沙利铂+亚叶酸钙+氟尿嘧啶）一线或帕博利珠单抗联合FOLFIRI方案（伊立替康+亚叶酸钙+氟尿嘧啶）二线治疗MSS/pMMR型转移性CRC的长期安全性和疗效。2020年报道，18例帕博利珠单抗联合mFOLFO7方案一线治疗组患者中，完全缓解（complete response, CR）1例，部分缓解（partial relief, PR）17例；5例帕博利珠单抗联合FOLFIRI方案二线治疗组患者均获得PR；两组的疾病控制率（disease control rate, DCR）分别为94%和63%。2022年报道了随访2.5年后的数据，帕博利珠单抗联合mFOLFO7方案一线治疗组31例患者中，CR 2例，PR 17例；帕博利珠单抗联合FOLFIRI方案二线治疗组32例患者中，PR 8例；均未出现新的治疗相关不良反应，提示帕博利珠单抗联合化疗一线、二线治疗MSS/pMMR型转移性CRC均安全有效。

METIMMOX研究是一项旨在对比FLOX方案（氟达拉滨+奥沙利铂）联合纳武利尤单抗与FLOX方案一线治疗MSS型转移性CRC疗效的Ⅱ期临床研究，主要终点是无进展生存时间（progression-free survival, PFS）。结果显示，联合纳武利尤单抗组患者的中位PFS为6.6个月，FLOX组患者的中位PFS为5.6个月。这项研究提示，MSS型转移性CRC患者短程奥沙利铂化疗后，可能改变肿瘤的免疫原性，诱发对ICIs的反应，但是可以预测ICIs反应性的生物标志物需要进一步研究。

法国的一项多中心Ⅱ期随机对照研究比较了阿替利珠单抗联合mDCF方案（多西他赛+顺铂+氟尿嘧啶）和mDCF方案治疗转移性或局部晚期鳞状细胞肛门癌的疗效，结果显示，两种治疗方法均具有较好的疗效和安全性，阿替利珠单抗联合mDCF方案组患者的1年无进展生存率为44.2%，但尚未达到主要终点。

免疫治疗联合化疗为MSS/pMMR型CRC患者带来了希望，有可能改善这类患者的预后，但还需要进一步验证联合治疗的安全性和有效性，并确定最佳的治疗方案和个体化策略。

放疗与免疫治疗联合已成为一种潜在的治疗策略，在一些肿瘤类型中显示出了一定的疗效。放疗与ICIs联合的可能机制包括放疗的局部效应、放疗的系统效应、ICIs的作用及免疫记忆的形成。MSS型CRC对免疫治疗不敏感，放疗理论上可以释放新抗原，是否能改变耐药还需要更多数据支持。

VOLTAGE研究显示，37例MSS型局部进展期直肠癌患者术前放化疗序贯5个周期纳武利尤单抗治疗，然后行手术切除，11例患者达到病理完全缓解（pathologic complete response, pCR），PD-L1阳性和CD8/eTreg比值升高是MSS型局部进展期直肠癌pCR的重要预测因素。

在NSABP FR-2研究中，于可手术直肠癌患者术前放化疗完成后3～7 d开始，进行4次度伐利尤单抗治疗（750 mg，每2周静脉输注1次），在术前放化疗后的8～12周内进行手术，结果显示，在术前放化疗治疗后立即使用度伐利尤单抗进行治疗是安全的，且无意外的短期不良反应，pCR率为22.2%，持续临床缓解率为31.1%。

我国的一项多中心回顾性真实世界研究显示，68例MSS/pMMR型CRC患者接受了新辅助治疗联合免疫治疗，主要是CapeOx方案（卡培他滨+奥沙利铂）联合程序性死亡蛋白1（programmed death-1, PD-1）抗体及长期或短期放疗，或PD-1抗体联合细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4）抗体（仅1例），新辅助免疫治疗1～10个周期，中位数为4个周期，pCR率为35.3%（24/68），主要病理缓解率为58.8%（40/68）。可见联合免疫治疗的新辅助治疗模式对可手术CRC的近期疗效显著，具有较好的安全性和有效性，但远期疗效、最佳周期数及预测免疫疗效的标志物仍需进一步探讨。

总之，放疗对肿瘤微环境的多效性影响包括免疫原性细胞死亡、胞质DNA传感器的激活、基质和脉管系统的重塑，以及抗肿瘤和抑制性免疫细胞群的矛盾性浸润。这些影响取决于照射剂量和分级，因此优化照射剂量和分级将是开发安全有效联合方案的关键。需要注意的是，考虑到患者的个体差异和潜在的不良反应，联合治疗的方案和应用条件需经过个体化评估和临床研究的指导。联合免疫治疗和DNA损伤反应抑制剂，有助于在放疗对免疫微环境的免疫原性和耐受性作用之间实现有利的平衡。

免疫治疗联合靶向治疗是当今CRC治疗领域的一个热点话题，其可能机制包括互补作用、免疫增强效应、耐药逆转及抑制转移和复发。其中常联合使用的靶向药物有小分子抗血管生成酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor, TKI）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）抗体、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）抗体等。

1. 免疫治疗联合小分子TKI：瑞戈非尼是一种口服小分子TKI，能够有效阻断多个蛋白激酶，包括参与肿瘤血管生成的血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR）-1、VEGFR-2、VEGFR-3和血管生成素受体2，参与肿瘤发生的干细胞因子受体、网织红细胞、快速增生的纤维肉瘤1和BRAF，参与肿瘤转移的血小板衍生生长因子受体和成纤维细胞生长因子受体，参与肿瘤免疫的集落刺激因子1受体。日本的REGONIVO研究纳入了25例晚期胃癌和25例CRC患者，既往接受的中位治疗线数为三线，瑞戈非尼联合纳武利尤单抗治疗后CRC患者的客观缓解率（objective response rate, ORR）为36%，排除1例MSI-H患者后ORR依然达到33%，中位PFS为7.9个月，中位总生存时间（overall survival, OS）未达到，PFS达1年以上的患者占41.8%，OS达1年以上的患者占68.0%；未观察到PD-L1综合阳性评分和TMB可以预测CRC患者的获益。2022年美国的一项类似研究显示，51例pMMR型转移性CRC患者接受了至少1剂瑞戈非尼+纳武利尤单抗治疗，在40例可评价疗效的患者中，4例获得PR，其中包括1例未经证实的PR，21例疾病稳定（stable disease, SD），DCR为63%，中位PFS和OS分别为4.3和11.1个月，表明此联合方案在pMMR型转移性CRC中的耐受性良好，抗肿瘤活性有限。一项包括14家中国医疗中心的真实世界研究显示，76例MSS/pMMR型CRC患者接受至少1个周期瑞戈非尼联合ICIs治疗，中位随访5.5个月，中位PFS为3.1个月，中位OS为17.3个月；无肝转移且基线时中性粒细胞/淋巴细胞比值较低的患者可能从该治疗方案中获益最多。可见，瑞戈非尼联合ICIs治疗MSS/pMMR型CRC的优势人群仍需进一步探索。

呋喹替尼是我国自主研发的小分子TKI，是一种高选择性VEGFR-1/2/3抑制剂。14个国家的124家医疗中心联合开展的FRESCO-2研究显示，无论CRC患者既往接受治疗线数和治疗方案如何，呋喹替尼均显示出一致的OS和PFS获益，且呋喹替尼的安全性和耐受性良好。国内一项研究显示，45例难治性非MSI-H/pMMR转移性CRC患者行呋喹替尼联合PD-1抑制剂（包括帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、信迪利单抗或卡瑞丽珠单抗）治疗，性别、年龄、体能状态评分、肿瘤位置、组织分化程度、Kirsten大鼠肉瘤病毒基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, KRAS）表达、转移器官数量、肝转移和肺转移等与患者的PFS和OS无关。Guo等报道，呋喹替尼（5 mg，每天1次）联合信迪利单抗（200 mg，每3周1次）能将MSS/pMMR型晚期CRC患者的中位OS提高至20个月（95% CI：8.1个月～未达到），中位PFS提高至6.9个月（95% CI：4.8～10.1个月），ORR提高至23.8%（95% CI：4.3%～48.1%），DCR达100%，改善了MSS/pMMR型晚期CRC的临床获益。LEAP-005研究显示，中位随访10.6个月，仑伐替尼联合帕博利珠单抗治疗32例晚期非MSI-H/pMMR CRC患者的ORR为22%，表现出良好的抗肿瘤活性和可控的安全性。

靶向治疗和免疫治疗是两种不同的治疗策略，二者联合可以产生协同效应，提高治疗效果，但可能增加一些风险和不良反应，因此还需要进一步研究和验证。另外，个体化治疗方案的优化也非常重要。

2. 免疫治疗联合靶向EGFR治疗±化疗：目前，大鼠肉瘤病毒性肿瘤基因家族（rat sarcoma viral oncogene homolog, RAS）野生型晚期CRC的标准治疗是化疗联合抗EGFR治疗。西妥昔单抗是重要的抗EGFR靶向药，可增加肿瘤内部CD8⁺ T淋巴细胞的密度，这为西妥昔单抗联合免疫治疗提供了理论基础。AVETUXIRI研究是一项Simon二阶段设计的多中心Ⅱ期临床研究，旨在探讨PD-L1抑制剂阿维单抗+西妥昔单抗+伊立替康治疗难治性MSS型转移性CRC的临床疗效和安全性，结果显示，中位随访9.2个月，RAS野生组和RAS突变组DCR分别为60.0%（6/10）和61.5%（8/13），中位PFS分别为4.2和3.8个月，中位OS分别为12.7和14.0个月。该研究达到了RAS野生型转移性CRC患者的主要疗效终点，RAS突变转移性CRC患者的DCR、PFS、OS结果也令人鼓舞，未来可以对RAS突变队列作更多拓展研究。

BRAF突变型转移性CRC对标准化疗和口服选择性BRAF V600E突变抑制剂均无有效反应，被认为是一种独特的实体瘤。Bolzacchini等使用PanCancer IO 360基因表达面板生成了89例免疫疗法无效的BRAF突变CRC患者的基因表达谱，发现其中很大一部分患者可能是免疫疗法的候选者，MSI状态和CD8⁺ TIL含量可以提高识别可能ICIs获益患者的准确性。有研究显示，康奈非尼联合西妥昔单抗和纳武利尤单抗对难治性MSS型BRAF V600E突变转移性CRC有效且耐受性良好，中位PFS为7.3个月，中位OS为11.4个月。这提示西妥昔单抗有可能介导抗肿瘤免疫反应，导致免疫原性肿瘤细胞死亡，也提示在转移性CRC免疫联合治疗领域还有非常大的探索空间。

3.免疫治疗联合靶向VEGF治疗±化疗：VEGF可促进有缺陷和渗漏的肿瘤血管生长，抑制免疫效应细胞的肿瘤浸润。抗VEGF治疗可以逆转这些免疫抑制机制，使肿瘤微环境正常化，促进免疫治疗发挥作用。

BACCI研究是一项多中心、双盲随机对照Ⅱ期研究，相对于卡培他滨+贝伐珠单抗+安慰剂，卡培他滨+贝伐珠单抗+阿替利珠单抗维持治疗并未给难治性转移性CRC患者带来生存获益，但ORR由4.35%提高到8.54%。作为首个PD-1/PD-L1抗体联合靶向VEGF治疗转移性CRC并获得阳性结果的研究，BACCI研究将有助于促进对治疗获益预测因素的探索。

BBCAPX研究表明，信迪利单抗联合CapeOx和贝伐珠单抗一线治疗改善了RAS基因突变的MSS型转移性CRC患者的疾病缓解情况，ORR高达84.0%，肝转移和肺转移的患者ORR分别为93.3%和100%，且不良反应可控，安全性表现良好。基于此Ⅱ期研究的结果，目前BBCAPX Ⅲ期研究已经在进行中，其结果令人期待。

AtezoTRIBE研究是一项开放标签的多中心随机对照Ⅱ期临床试验，结果显示，与FOLFOXIRI方案（伊立替康+奥沙利铂+氟尿嘧啶）联合贝伐珠单抗组相比，加用阿替利珠单抗一线治疗CRC的PFS更优（中位PFS分别为13.1和11.5个月，HR=0.70，80%CI：0.57～0.87；P=0.018），但从安全性来看，加用阿替利珠单抗组有2例（1%）治疗相关死亡（死因分别为急性心肌梗死和支气管肺出血），对照组则未发生治疗相关死亡。

在MODUL研究中，对一线治疗后SD的晚期MSS型CRC患者采用氟尿嘧啶+贝伐珠单抗联合或不联合阿替利珠单抗进行维持治疗，联合阿替利珠单抗组和不联合阿替利珠单抗组患者的中位PFS分别为7.39和7.20个月，OS分别为21.91和22.05个月，表明在维持治疗时加入免疫治疗并不改善晚期MSS型CRC患者的预后。

NIVACOR试验（GOIRC-03-2018）是一项Ⅱ期研究，采用FOLFOXIRI方案化疗联合贝伐珠单抗和纳武利尤单抗一线治疗73例RAS/BRAF突变晚期CRC患者，每2周1次，持续8个周期，然后贝伐珠单抗+纳武利尤单抗维持治疗，每2周1次，中位随访14.3个月，ORR为76.7%，DCR为97.3%；在MSS亚组（n=52）患者中，ORR为78.9%，DCR为96.2%。

在2022年美国临床肿瘤协会（American Society of Clinical Oncology, ASCO）年会上公布了一项卡培他滨联合贝伐珠单抗和帕博利珠单抗治疗MSS型转移性CRC的Ⅱ期研究结果，所观察到的不良反应均在预期之中，且均可耐受；中位随访8个月，40例可评估疗效的患者ORR为5%（95% CI：0.6%～16.9%），PR率为5%，SD率为65%，2例PR患者的缓解持续时间分别为12和15个月；中位PFS为4.3个月（95% CI：3.9～6.1个月），6个月无进展生存率为34.5%（95% CI：22.5%～53.1%），中位OS为9.64个月（95% CI：6.7～11.8个月）。该研究5%的ORR未达到15%的预定目标，但34.5%的患者PFS超过6个月，后续针对肿瘤活检组织和外周血的免疫分析结果值得期待。

在MEDITREME研究中，采用FOLFOX方案化疗联合度伐利尤单抗（150 mg，2周1次）和替西木单抗（75 mg，4周1次）治疗57例RAS突变MSS型转移性CRC患者，中位治疗13.4个月后结果显示，主要研究终点中位PFS未达到，6个月无进展生存率为62.5%，1年无进展生存率为50%；次要终点DCR为87.5%，ORR为62.5%，CR率为25%。该研究的结果未达到预期，双免疫治疗联合化疗这一策略尚需要进一步评估。

CCTG CO.26研究的主要目的是评估PD-L1和CTLA-4联合抑制是否能提高转移性难治性CRC患者的生存率。纳入的180例MSS型CRC患者中，166例为经治患者。仅接受单纯最佳支持治疗的患者中位OS为4.1个月（90% CI：3.3～6.0个月），接受度伐利尤单抗+替西木单抗+最佳支持治疗的患者中位OS为6.6个月（90% CI：6.0～7.4个月），HR=0.66（90% CI：0.49～0.89，P=0.02）；在MSS/pMMR型CRC患者中，TMB≥28的患者OS获益最大（HR=0.34，90% CI：0.18～0.63，P=0.004）。此研究表明，血浆TMB升高可能会筛选出最有可能从度伐利尤单抗和替西木单抗中获益的患者，循环核酸检测得出的TMB可能是预测ICIs疗效的潜在生物标志物。

抗EGFR治疗能引起肿瘤特异性免疫反应和免疫原性细胞凋亡，其耐药机制多与PD-L1和CTLA-4表达增加有关。在LCCC1632研究中，采用帕尼单抗+伊匹木单抗+纳武利尤单抗治疗56例KRAS/NRAS/BRAF野生型MSS型转移性CRC患者，患者之前接受过1～2种方案的治疗，不包括EGFR抑制剂和ICIs。在49例可评估患者中，治疗第12周时有35%达到了临床缓解，43%为SD，中位PFS为5.7个月。此次“O+Y”双免疫治疗联合帕尼单抗的成功，为MSS型转移性CRC患者的治疗提供了新思路。

博特利单抗（AGEN1181）为人源化抗CTLA-4单克隆抗体，是一种先天性和适应性免疫激活剂，具有增强的Fc区，可促进药物与抗原呈递细胞和自然杀伤细胞上Fcγ受体的结合。巴替利单抗（AGEN2034）是一种针对PD-1的完全人单克隆IgG4抗体，可以高亲和力、选择性地与PD-1结合，并通过阻断PD-L1和PD-L2与PD-1结合增强T细胞的反应性。在2023年ASCO胃肠癌研讨会上发布了博特利单抗联合巴替利单抗治疗难治转移性MSS型CRC患者的Ⅰa/Ⅰb期研究（NCT03860272）结果，59例患者可用于评估疗效和安全性，中位随访6.4个月，ORR为22%，DCR为73%。中位PFS为4.1个月，中位OS未达到，12个月OS率为61%，其中无肝转移患者的12个月OS率为81%，有肝转移患者的12个月OS率为40%。这为晚期MSS型CRC的后线治疗带来了新的希望。

在MSS/pMMR型转移性CRC的治疗中，免疫联合治疗的探索涉及了免疫治疗与丝裂原激活蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（mitogen-activated or extracellular signal-regulated protein kinase, MEK）抑制剂、表观遗传调节剂、环氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）抑制剂、C-C趋化因子受体5型（C-C chemokine receptor type 5, CCR5）抑制剂、淋巴细胞活化基因3（lymphocyte-activation gene 3, LAG-3）抗体、T细胞免疫球蛋白和黏蛋白3（T cell immunoglobulin and mucin-3, TIM-3）抗体、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白（glucocorticoid-induced TNFR-related protein, GITR）抗体、转化生长因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）抑制剂、肠道菌群重建、肿瘤相关中性粒细胞（tumor associated neutrophils, TANs）等的联合应用，这些联合治疗策略的探索旨在将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤，以提高晚期MSS/pMMR型转移性CRC的治疗效果。

MEK是RAS/丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号传导通路中的关键介质，参与细胞增殖、存活和转化等生物学过程。MEK抑制剂通过抑制MEK的活性，可以影响RAS/MAPK通路的信号传导，阻断异常活化的细胞信号，抑制癌细胞的生长和扩散。IMblaze370研究入组了既往接受过多线治疗后失败的CRC患者，结果显示，PD-L1抑制剂阿替利珠单抗联合MEK抑制剂考比替尼治疗组患者的中位OS为8.9个月，阿替利珠单抗单药治疗组患者的中位OS为7.1个月，并未超过瑞戈非尼单药治疗组患者（中位OS为8.5个月）。因此，MEK抑制剂联合免疫治疗是否具有协同效应，还有待进一步探索。

表观遗传调节剂是一类用于调控细胞表观遗传修饰的化合物，这些修饰可以调节基因的表达，从而对细胞功能和生命过程产生影响。地西他滨是S期细胞周期特异性药物，通过抑制DNA甲基转移酶减少DNA甲基化，从而抑制肿瘤细胞增殖以及防止耐药的发生，是目前已知最强的DNA甲基化特异性抑制剂，可以上调肿瘤相关抗原和人类白细胞抗原分子。研究表明，低剂量地西他滨可以诱导和改善CRC细胞中重要的肿瘤相关抗原纽约食管鳞状细胞癌1的表达，特别是在MSS细胞系中，其可以被过继转移的T细胞受体工程化T细胞（T-cell receptor engineered T cells, TCR-T）更有效地识别和破坏。低剂量地西他滨和TCR-T细胞联合，可能改善免疫细胞向肿瘤部位的浸润，是MSS型CRC的潜在治疗策略。Huang等报道，地西他滨诱导DNA低甲基化，不仅直接促进肿瘤PD-L1的表达，而且在体外和体内增加免疫相关基因的表达和CRC组织中T细胞的浸润，显著提高PD-L1抑制剂免疫治疗的疗效。Yu等的研究表明，与地西他滨或PD-1抑制剂单药治疗相比，在地西他滨联合PD-1抑制剂治疗后的CT26小鼠模型中能观察到更显著的肿瘤生长抑制和生存时间延长，这提示低剂量地西他滨通过重新调节肿瘤微环境增强了抗PD-1作用，为ICIs提供了更合适的免疫微环境。

替莫唑胺是一种具有广谱抗肿瘤活性的口服烷化剂，其抗肿瘤活性依赖于鸟嘌呤O⁶位置的DNA甲基化，而替莫唑胺耐药的主要机制是DNA修复酶O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O⁶-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT）的表达，因此MGMT沉默代表暴露于替莫唑胺治疗后的合成致死机制。MAYA试验评估了免疫增敏策略对MGMT沉默的MSS型转移性CRC患者的有效性和安全性，135例符合入组条件的患者接受了第1部分治疗（替莫唑胺150 mg/m²，连续5 d口服，每4周为1个周期，最多6个周期），其中102例患者因死亡或进展而停止治疗，达到疾病控制的33例患者进行第2部分治疗（替莫唑胺150 mg/m²，连续5 d口服，每4周为1个周期；尼伐普利240 mg，静脉注射，每2周1次；伊匹单抗1 mg/kg，静脉注射，每6周1次）。中位随访23.1个月后，完成2部分治疗的33例患者8个月无进展生存率为36%，中位PFS和OS分别为7.0和18.4个月，ORR为45%。MAYA研究证实替莫唑胺预处理可诱导超突变，这提示经过替莫唑胺的一系列预处理，然后结合低剂量伊匹木单抗和纳武利尤单抗可能会为MGMT沉默的MSS/pMMR型转移性CRC患者带来持久的临床获益。

需要注意的是，表观遗传调节剂尚处于研究和开发阶段，具体的作用机制和临床应用仍需进一步研究和验证。

COX-2/前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）途径可以促进胃肠道肿瘤的发展，COX-2/PGE2通路的抑制不仅抑制肿瘤细胞增殖、存活、侵袭和迁移，而且可以消除肿瘤干细胞。NICHE研究是第1项针对结肠癌的新辅助免疫治疗研究，采用纳武利尤单抗+伊匹木单抗联合塞来昔布新辅助治疗30例pMMR结肠癌患者，9例达到病理缓解（3例CR，2例PR），CD8⁺ PD-1⁺ T细胞浸润可预测pMMR肿瘤的反应。该研究在MSS型CRC患者的治疗中加用选择性COX-2抑制剂塞来昔布获得了一定疗效，推测靶向肿瘤干细胞可能为MSS型转移性CRC患者提供一种新的治疗方法。免疫治疗和COX-2抑制剂联合应用的具体机制和对MSS/pMMR型CRC的疗效仍需深入研究和临床验证。此外，免疫治疗和COX-2抑制剂联合应用时需要密切监测不良反应和相互作用，以确保安全有效的治疗。

在CRC组织间质中，CD4⁺和CD8⁺ T细胞能够产生趋化因子（C-C基序）配体5［chemokine （C-C motif） ligand 5, CCL5］，而肿瘤细胞表达其受体CCR5。有研究显示，阻断CCL5/CCR5通路能诱导刺激肿瘤生长的相关细胞因子表达下调，改善肿瘤周围的炎性微环境，促使M2型肿瘤相关巨噬细胞转化成具有肿瘤杀伤作用的M1型巨噬细胞，进而发挥抗肿瘤作用。PICCASSO研究显示，20例MSS型转移性CRC患者经过帕博利珠单抗联合CCR5抑制剂治疗8个周期后，接受帕博利珠单抗单药治疗，结果显示，1例患者出现了4级高血糖，未见其他≥3级治疗相关不良反应；19例可评价疗效的患者中，仅1例PR，其他18例均为疾病进展（progressive disease, PD）。可见，帕博利珠单抗与CCR5抑制剂的联合安全性没问题，但疗效一般，不过也算为MSS型CRC的治疗带来了一个新的思路，期待进一步的研究数据。需要指出的是，CCR5抑制剂目前还处于研究和开发阶段，其具体机制和疗效尚需进一步研究和验证。因此，在实际应用中，需要根据患者的具体情况和医师的指导选用，并密切监测治疗的安全性和效果。

LAG-3是一种负调控T细胞活化的抑制性免疫受体，能够与PD-1协同抑制CD8⁺ T细胞的活性。目前，针对LAG-3的免疫球蛋白IMP321在多种实体瘤的Ⅰ期临床研究中表现出了一定的抗肿瘤活性。在食蟹猴体内进行的不良反应研究显示，瑞拉利单抗和纳武利尤单抗联合使用耐受性良好。Schöffski等比较了LAG-3抑制剂埃拉利单抗联合抗PD-1抗体斯巴达珠单抗（n=121，其中CRC患者7例）与单药埃拉利单抗（n=134，其中CRC患者14例）治疗晚期恶性肿瘤患者的疗效和安全性，结果显示，埃拉利单抗联合斯巴达珠单抗具有适度的抗肿瘤活性，不良反应与单药埃拉利单抗相当，常见的治疗相关不良反应为疲劳、腹泻、恶心、瘙痒和皮疹，严重程度较轻。

TIM-3在T细胞、Treg细胞、树突细胞、自然杀伤细胞以及单核细胞表面表达，能够与PD-1和CTLA-4在免疫反应中发挥协同作用。Curigliano等纳入219例实体瘤患者（其中以卵巢癌和CRC患者居多，分别占17%和7%），观察了抗TIM-3抗体sabatolimab联合抗PD-1抗体spartalizumab治疗的疗效和安全性，结果显示，sabatolimab与spartalizumab联合初步显示出抗肿瘤活性，且患者对药物的耐受性良好。

GITR是一种糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白，其配体GITRL作为重要的T淋巴细胞协同刺激分子，可以直接与GITR特异性结合，也可以被酶切后形成可溶性胞外段与GITR特异性结合，不仅具有促进效应T淋巴细胞增殖和调控效应T淋巴细胞功能的作用，还能调控Treg细胞增殖。Piha-Paul等观察了抗GITR抗体GWN323联合spartalizumab（n=53）对比GWN323单药（n=39）治疗晚期实体瘤和淋巴瘤的疗效，联合治疗组可评价疗效的患者中，CR 1例，PR 3例，SD 14例，PD 26例；单药治疗组可评价疗效的患者中，SD 7例，PD 26例。因此，对于免疫治疗难治性MSS型CRC，活化T细胞表面的GITR可能会成为较有前景的治疗手段之一。

肿瘤微环境中TGF-β的增加可促进T细胞排斥并阻断辅助性T细胞1效应表型的获得，是免疫逃逸的主要机制。这提示采用TGF-β抑制剂抑制TGF-β信号通路可能会提高PD-1/PD-L1靶向药物的治疗效果。德国默克公司研发的新药bintrafusp alfa（M7824）是一种抗PD-L1/TGF-β的融合蛋白，目前在非小细胞肺癌中显示出一定的临床活性和可控的安全性。有研究表明，TGF-β通过促进内皮-间质转化、血管生成及免疫抑制肿瘤微环境，调节转移性CRC细胞的干性和其他机制在CRC转移中发挥重要作用。因此，将TGF-β靶向与免疫治疗相结合以提高MSS型转移性CRC的疗效具有巨大潜力。

免疫治疗联合肠道菌群重建是近年来受到越来越多关注的领域。肠道菌群在免疫调节中起着重要作用，且与免疫系统之间存在相互作用。临床前研究显示，肠道微生物组的变化影响甘油磷脂代谢途径，从而调节PD-1抗体在MSS型CRC荷瘤小鼠免疫治疗中的治疗潜力。抗PD-L1治疗的应答者含有丰富的细菌种类，如长双歧杆菌、产气柯林斯氏菌和粪肠球菌等。这些研究提示菌群移植或肠道菌群重建有可能改善基于PD-1/PD-L1及CTLA-4的ICIs的疗效，肠道菌群有望成为预测CRC免疫治疗疗效的重要指标，而对肠道菌群重建有可能给MSS型CRC带来免疫治疗获益。

TANs是一种存在于肿瘤微环境中的白细胞，主要由中性粒细胞组成，在肿瘤发展中起着重要作用。TANs与巨噬细胞相似，在不同因子的趋化作用下可以分化为抗肿瘤TANs和促肿瘤TANs，也具有N1和N2表型，通过不同的细胞因子或趋化因子被募集和极化，然后发挥抗肿瘤或促肿瘤作用。以TANs为靶点的肿瘤免疫治疗机制包括以下方面：（1）抑制TANs的功能：可以降低TANs对肿瘤生长和转移的促进作用；（2）阻断TANs与其他免疫细胞的相互作用：TANs与其他免疫细胞（如T细胞）之间的相互作用可以抑制免疫细胞的活性，从而减弱对肿瘤的免疫应答，因此，通过阻断TANs与其他免疫细胞的相互作用，可以增强免疫细胞对肿瘤的攻击能力；（3）调节TANs的免疫抑制分子表达：TANs表达的免疫抑制分子（如PD-L1）可以抑制免疫细胞的活性，从而减弱对肿瘤的免疫应答，因此，通过调节TANs的免疫抑制分子表达，可以增强免疫细胞对肿瘤的攻击能力；（4）阻断TANs的趋化因子受体：TANs的趋化因子受体介导了其在肿瘤组织中的积聚，通过阻断TANs的趋化因子受体，可以减少TANs在肿瘤组织中的数量，从而减弱其对肿瘤的促进作用。

总之，免疫治疗和LAG-3抗体或TIM-3抗体联合应用显示出潜在的协同效应，免疫治疗联合GITR抗体、TGF-β抑制剂以及肠道菌群重建的确切机制和疗效尚需进一步深入研究和验证，因此，在实际临床应用中，建议根据患者的具体情况和治疗目标来确定是否采用联合治疗，并密切监测治疗的安全性和疗效。需要指出的是，目前我们对TANs在肿瘤发展中的作用及具体机制的了解尚不完全，需要进一步深入研究为开发针对TANs的免疫治疗策略带来新的启示。TANs与ICIs联合应用可能成为MSS型CRC的一种新的治疗模式。

MSS/pMMR型CRC免疫治疗的潜在疗效预测标志物包括PD-L1、循环肿瘤DNA、聚合酶ε（polymerase epsilon, POLE）和聚合酶δ（polymerase delta, POLD1）突变、修复错误基因突变在预测MSS/pMMR型CRC免疫治疗的疗效方面具有重要意义。

PD-L1是一种蛋白质，是免疫检查点通路中的重要组成部分。它主要通过与PD-1结合抑制免疫细胞的活性，从而帮助肿瘤细胞逃避免疫系统的攻击。通过检测PD-L1的表达可以帮助预测ICIs在许多实体瘤中的疗效，然而，PD-L1在转移性CRC中，尤其是在MSS/pMMR型CRC中的表达模式和预后意义仍然存在争议。一项回顾性研究显示，在MSS/pMMR型CRC中，PD-1和PD-L1的表达与患者的无复发生存时间无关，而在MSI-H型CRC中，PD-L1高表达患者的无复发生存时间比PD-L1低表达患者差。

Wang等报道，接受PD-1抑制剂联合瑞戈非尼治疗的18例转移性MSS型CRC患者，治疗后第4周循环肿瘤DNA的增加可预测患者治疗后2个月时的肿瘤进展。循环肿瘤DNA可能是预测MSS型CRC患者免疫治疗早期疗效的有力工具。

POLE和POLD1是参与DNA复制的酶，在DNA合成和修复中起着至关重要的作用。一项对6 517例Ⅱ～Ⅲ期CRC患者的大样本回顾性研究显示，66例（1%）患者存在POLE体细胞突变，与POLE野生型MSS/pMMR型CRC相比，表现出更高的CD8⁺ T细胞浸润。Wen等报道了4例携带POLE外切酶结构域突变并伴肝转移CRC患者接受ICIs联合化疗治疗的疗效，4例患者均获得pCR，中位随访14个月后均未出现进展。

HRR是一种修复DNA双链断裂的重要途径。HRR基因的突变状态会影响肿瘤对免疫治疗的反应。有研究显示，HRR基因突变显著增强了MSS型CRC的免疫活性，增加了细胞毒性细胞浸润（P＜0.05）和耗尽的CD8⁺ T细胞（P＜0.01），并提高了γ-干扰素评分（P＜0.05），而在MSI-H型CRC患者中的结果不同（均P＞0.05）。这表明HRR突变状态有可能作为MSS型CRC免疫治疗反应的预测指标。目前，HRR基因突变状态检测在MSS型CRC免疫治疗中的预测作用仍处于研究阶段，且结果存在差异，HRR基因突变在MSS型CRC免疫治疗中的潜在作用还有待开展进一步研究加以阐明。

免疫联合治疗在MSS/pMMR型CRC中面临一些挑战，但仍然具有潜在的应用前景，许多相关研究和临床试验正在进行中，以期找到更有效的联合治疗方案。目前，越来越多的晚期CRC患者进入三线及后线治疗，因此如何制定治疗策略、选择联合用药成为需要面对的重要问题。

纵观MSS/pMMR型CRC免疫联合治疗方案的研究探索过程，成功的案例相对较少。我们认为最主要的原因在于不同联合方案中药物的差异。例如，REGONIVO研究在MSS型CRC方面取得了突破性的进展，其结果在REGOTORI研究中并未得到重复，然而信迪利单抗联合呋喹替尼在MSS型CRC患者中显示出明显的效果，为患者带来了益处。

不同联合治疗方案的成功和失败提示，针对MSS/pMMR型转移性CRC的免疫治疗以及免疫联合靶向治疗可能需要对获益人群进行筛选，应该基于免疫表型和分子分型进行有针对性的联合治疗，而非泛人群的联合治疗。另外，联合治疗方案的组合、药物顺序和剂量等仍值得进一步探索，药物本身的治疗靶点以及联合方案之间是否存在协同作用需要特别关注。

随着对肿瘤免疫调控机制认识的逐渐清晰以及基因改造技术的进步，肿瘤免疫治疗领域正迎来巨大的发展空间。基于肿瘤微环境的免疫治疗策略将成为提高免疫治疗效果的重要手段。在肿瘤微环境中，肿瘤浸润免疫细胞发挥着重要作用，其中包括CD8⁺ T细胞、CD4⁺ T细胞和自然杀伤细胞等。这些免疫细胞可以通过识别和攻击肿瘤细胞来抑制肿瘤的生长和转移，是潜在的治疗靶标。此外，还有一些潜在的治疗靶点，例如TMB、循环肿瘤DNA、POLE或POLD1突变和HRR基因突变状态等。基于CMS分型的研究对于探索MSS型CRC免疫耐药机制具有巨大的潜力。肿瘤疫苗、过继T细胞疗法、嵌合抗原受体T细胞等新的治疗手段也在积极向临床推进。

MSS/pMMR型CRC免疫治疗未来的发展，首先需要深入开展病因学研究，在此基础上，结合患者的免疫表型和分子分型，方能制定出更加精确和有效的免疫联合治疗策略。其次，需要研发更多新型药物，探索更多的联合治疗或序贯治疗模式。第三，寻找更多生物标志物等。通过这些努力，我们可以优化临床治疗策略，进一步提高MSS/pMMR型转移性CRC的治疗效果。