rigosertib联合化疗对KRAS突变型结直肠癌小鼠的疗效和不良反应

张昊晨, 周欣毅, 富栋梁, 等. rigosertib联合化疗对Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物突变型结直肠癌小鼠的疗效和不良反应[J]. 中华肿瘤杂志, 2023, 45(2):138-145. DOI:10.3760/cma.j.cn112152-20210514-00379.

 摘   要 

目的

探讨rigosertib(RGS)与结直肠癌经典化疗药物联合对KRAS突变型结直肠癌的疗效及不良反应。

方法

通过裸鼠皮下接种构建KRAS突变型结直肠癌模型，采用随机数字表法及随机数余数法随机分为对照组、RGS组、5－氟尿嘧啶(5－FU)组、奥沙利铂(OXA)组、伊立替康(IRI)组、5－FU+RGS组、OXA+RGS组和IRI+RGS组，观察各组小鼠体重和肿瘤体积的变化，采用免疫组化染色、原位末端标记荧光染色、Western blot法检测肿瘤组织增殖抑制及凋亡情况，通过小鼠血常规、血生化及肝脏组织切片HE染色分析化疗联合RGS的不良反应情况。采用细胞计数试剂盒8检测OXA与RGS联用对KRAS突变型结直肠癌细胞DLD1和HCT116的协同作用。

结果

对照组、RGS组、5－FU组、OXA组、IRI组、5－FU+RGS组、OXA+RGS组和IRI+RGS组小鼠移植瘤均成瘤，肿瘤生长快慢不一，其中OXA+RGS组肿瘤增长较慢。到给药后55 d，OXA+RGS组的肿瘤体积倍数为37.019±8.634，均小于RGS组(77.571±15.387， P＝0.029)和OXA组(92.500±13.279， P＝0.008)，具有协同效应。免疫组化染色显示，对照组、OXA组、RGS组和OXA+RGS组小鼠移植瘤组织Ki－67指数分别为(100.0±16.8)%、(35.6±11.3)%、(54.5±18.1)%和(15.4±3.9)%，OXA+RGS组低于对照组( P＝0.014)，但与OXA组和RGS组比较差异无统计学意义(均 P>0.05)。TUNEL荧光染色结果显示，OXA+RGS组凋亡细胞荧光信号强度为3.878±0.547，高于OXA组(1.515±0.442， P＝0.005)和RGS组(1.966±0.261， P＝0.008)。Western blot检测结果显示，OXA+RGS组小鼠移植瘤组织中cleaved－PARP、cleaved－caspase 3和cleaved－caspase 8等凋亡相关蛋白表达量均高于对照组、OXA组和RGS组。裸鼠接受RGS、5－FU、OXA、IRI等单药和联合治疗后，未见明显肝肾功能损害，但OXA+RGS组白细胞为(0.385±0.215)×10⁹/L，血红蛋白为(56.000±24.000)g/L，均低于对照组[分别为(5.598±0.605)×10⁹/L和(153.333±2.231)g/L，均 P<0.01]。

结论

RGS与5－FU、IRI联用治疗KRAS突变型结直肠癌不能增强疗效，但与OXA联用具有更强的抗肿瘤效应。RGS单药不会对小鼠造成明显的骨髓抑制和肝肾功能损伤，但与OXA联用不良反应可能会相应增加。

【关键词】结直肠肿瘤;Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物;Rigosertib;靶向治疗;化疗

结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一。Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, KRAS)基因突变在结直肠癌患者中的发生率约为42%，在结直肠癌的发生发展中起到了关键作用，存在KRAS突变的患者预后较差。由于KRAS蛋白自身结构的特殊性，缺乏药物的结合位点，存在KRAS突变的患者目前仍缺乏有效的针对性药物，临床上往往采用化疗联合贝伐珠单抗的方案。Tang等报道，初始不可切除的RAS突变型结直肠癌伴肝转移患者接受FOLFOX方案[5－氟尿嘧啶(5－Fluorouracil, 5－FU)+奥沙利铂(oxaliplatin, OXA)]联合贝伐珠单抗治疗的中位总生存时间不足2年。我们的前期研究显示，RAS小分子模拟物rigosertib(RGS)能够通过抑制RAS下游通路的活化特异性地抑制KRAS突变型结直肠癌的生长，理论上可以在结直肠癌中作为针对KRAS突变的靶向药。目前，临床上晚期结直肠癌的化疗以5－FU、OXA、伊立替康(irinotecan, IRI)为主。在本研究中，我们通过观察5－FU、OXA和IRI分别联合RGS对KRAS突变型结直肠癌细胞移植瘤小鼠模型的抗肿瘤效应及不良反应，初步评估其疗效和安全性，为RGS联合化疗方案的临床转化提供参考。

材料与方法

一、材料

1．主要试剂：

抗GAPDH抗体、一抗稀释液、封闭液、原位末端标记(TdT－mediated dUTP nick－end labeling, TUNEL)荧光试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，RGS、5－FU、OXA、IRI、SN38购自美国Selleck公司，细胞计数试剂盒8(cell counting kit－8, CCK－8)购自武汉博士德生物工程有限公司，抗cleaved－caspase 3抗体、抗cleaved－caspase 8抗体、抗多聚ADP核糖多聚酶(poly ADP－ribose polymerase, PARP)抗体、抗cleaved－PARP抗体、抗Ki－67抗体购自美国CST公司，蛋白定量试剂盒购自美国Thermo Fisher公司。

2．细胞系：

KRAS突变型人结直肠癌细胞系DLD1和HCT116购自中国科学院上海细胞库。

3．实验动物：

BAL B/c裸鼠35只，雌性，4~5周龄，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。无特定病原体级环境下饲养于浙江大学医学院附属第二医院动物实验中心。

二、实验方法

1．裸鼠皮下移植瘤模型的建立：

将DLD1细胞系(KRAS^G13D突变)消化后制备成细胞悬液，每只小鼠皮下接种1×10⁶个细胞构建皮下移植瘤模型。

2．实验分组：

待肿瘤体积达到约50 mm³后，将荷瘤小鼠采用随机数字表法及随机数余数法分为对照组( n＝5)、RGS组( n＝6)、5－FU组( n＝7)、OXA组( n＝7)、IRI组( n＝7)。每种药物均采用腹腔注射，给药剂量参考已有研究，具体如下：RGS：100 mg/kg，每周5 d，每天1次；5－FU：20 mg/kg，每周3 d，每天1次；OXA：10 mg/kg，每周1次；IRI：20 mg/kg，每周1次；每种药物均给药至第55天。第19天时，将3组化疗单药组小鼠分别重新分为2组，一组继续采用单药化疗方案( n＝3)，另一组在原化疗药物基础上加用RGS，分别为5－FU+RGS组( n＝4)、OXA+RGS组( n＝4)和IRI+RGS组( n＝4)。

3．CCK－8实验：

分别取适量对数生长期的DLD1和HCT116细胞，消化后用培养基混匀，接种于96孔板。待细胞贴壁稳定后加入不同浓度的药物，48 h后弃去旧培养基，加入100 μl新鲜培养基和10 μl CCK－8溶液，测定吸光度。

4．药物联合指数(combination index, CI)计算：

使用CompuSyn软件计算两药联用时的CI值。如果CI<1表明两药具有协同作用，如果CI＝1则两药具有累加效应，如果CI>1则两药存在拮抗作用。

5．HE染色：

取小鼠肝脏组织切片，二甲苯中脱蜡，依次以无水乙醇、90%乙醇、70%乙醇、蒸馏水浸泡。苏木精水溶液中染色后，放入70%和90%的酒精中脱水，酒精伊红染色液染色。染色后的切片经脱水后中性树脂封片。

6．免疫组化检测：

取小鼠肿瘤组织切片，二甲苯中脱蜡，无水乙醇、90%乙醇、70%乙醇、蒸馏水浸泡。加入柠檬酸缓冲液进行抗原修复。清水冲洗后将切片置于PBS中浸泡。封闭后加入一抗稀释液孵育过夜。加入二抗孵育。磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)清洗。加入DAB显色剂显色，清水充分冲洗。苏木精染色，清水充分冲洗，脱水，中性树脂封片。

7．TUNEL荧光染色：

取小鼠肿瘤组织切片，二甲苯脱蜡，无水乙醇、90%乙醇、70%乙醇、蒸馏水依次浸泡。滴加20 μg/ml不含脱氧核糖核酸酶的蛋白酶K。按照TdT酶∶荧光标记液＝1∶9的比例配置适量TUNEL检测液。实验组在切片上加50 μl TUNEL检测液，阴性对照组加入荧光标记液，阳性对照组事先加入脱氧核糖核酸酶Ⅰ反应10 min，37 ℃避光孵育，PBS洗涤，滴加4′，6－二脒基－2－苯基吲哚二盐酸盐染液，室温避光孵育。用抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜下观察，使用Image J软件测定凋亡细胞荧光信号强度。各实验组的凋亡细胞荧光信号强度为以对照组为参照的相对值。

8．Western blot检测：

取适量肿瘤组织，匀浆、裂解后采用BCA法测定蛋白浓度。加入适量的细胞裂解液将不同样本稀释至均一浓度(1 μg/μl)，加入Loading缓冲液煮沸10 min。将组织样本加入孔道，依次经过电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育后曝光显影，成像后保存图片并分析。

9．血液样本检测：

摘除小鼠眼球取血，置于EDTA.2K预处理的抗凝离心管中，由浙江中医药大学动物实验研究中心进行小鼠血常规及血生化分析。

三、统计学方法

应用GraphPad Prism 8.0和SPSS statistics 23.0进行统计分析。计量资料以x±s表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Holm－Sidak法或Tukey法，检验水准α＝0.05。

结  果

1．RGS联合化疗对KRAS突变型结直肠癌细胞系小鼠皮下种植瘤的抗肿瘤效应：

对照组、RGS组、5－FU组、OXA组、IRI组、5－FU+RGS组、OXA+RGS组和IRI+RGS组小鼠移植瘤均成瘤，肿瘤生长快慢不一，其中对照组、5－FU组、5－FU+RGS组肿瘤增长较快，OXA+RGS组肿瘤增长较慢(图1)，各组小鼠体重变化不大(图2)。

在给药后第16天时，RGS组的肿瘤体积倍数为7.540±0.645，小于对照组(12.851±3.792； q＝4.31， P＝0.022； 图3)。在给药后第55天时，5－FU组的肿瘤体积倍数为132.445±47.268，与对照组(144.760±43.199)比较差异无统计学意义( q＝0.52， P＝0.983)；5－FU+RGS组的肿瘤体积倍数为170.128±113.580，大于RGS组(77.571±15.387； q＝4.39， P＝0.011)，表明5－FU和RGS联用不仅没有增强RGS的疗效，肿瘤体积甚至明显增大(图4)。OXA+RGS组肿瘤体积受到显著抑制，在给药后第55天时，OXA+RGS组的肿瘤体积倍数为37.019±8.634，小于RGS组(77.571±15.387； q＝3.93， P＝0.029)和OXA组(92.500±13.279； q＝4.55， P＝0.008；图5)。OXA+RGS组肿瘤重量为(2.085±0.226)g，小于对照组[(4.340±0.686)g； t＝2.81， P＝0.026]、RGS组[(5.062±0.952)g； t＝2.47， P＝0.038]和OXA组[(2.987±0.196)g； t＝2.87， P＝0.035])。在给药后第55天时，IRI组的肿瘤体积倍数为45.619±13.973，小于对照组(144.760±43.199； q＝8.46， P<0.001)，但IRI+RGS组的肿瘤体积倍数(55.763±8.735)与IRI组( q＝0.83， P＝0.936)和RGS组(77.571±15.387； q＝2.11， P＝0.445)比较差异均无统计学意义(图6)。

2．RGS联合化疗药物对KRAS突变型结直肠癌细胞的抗肿瘤作用：

CCK－8法检测结果显示，OXA联合RGS对DLD1和HCT116细胞的抑制作用要强于单药。在抑制率为50%时，OXA和RGS对DLD1和HCT116细胞的CI值分别为0.538和0.621，均<1，表明RGS和OXA具有协同作用(图7、图8)；而5－FU联合RGS、SN38联合RGS处理DLD1细胞后，抑制率为50%时，CI值分别为1.384和1.419，均>1，表明RGS和SN38、5－FU可能存在一定拮抗作用。

3．OXA联合RGS治疗对KRAS突变型结直肠癌模型小鼠肿瘤组织增殖和凋亡的影响：

免疫组化染色结果显示，对照组、OXA组、RGS组和OXA+RGS组小鼠移植瘤组织Ki－67指数分别为(100.0±16.8)%、(35.6±11.3)%、(54.5±18.1)%和(15.4±3.9)%，OXA组和RGS组与对照组差异无统计学意义( t＝3.32， P＝0.052； t＝2.35， P＝0.175)，OXA+RGS组低于对照组( t＝4.36， P＝0.014)，但与OXA组和RGS组差异无统计学意义( t＝1.04， P＝0.549； t＝2.02， P＝0.218；图9)。TUNEL荧光染色结果显示，OXA组和RGS组有一部分细胞凋亡，而OXA+RGS组凋亡水平显著增高，其凋亡细胞荧光信号强度为3.878±0.547，均高于OXA组(1.515±0.442； t＝4.33， P＝0.005)和RGS组(1.966±0.261； t＝3.50， P＝0.008；图10)。Western blot检测结果显示，OXA+RGS组小鼠移植瘤组织中cleaved－PARP、cleaved－caspase 3和cleaved－caspase 8等凋亡相关蛋白表达量均高于对照组、OXA组和RGS组(图11)。DLD1细胞在经RGS和OXA作用后，Western blot检测结果(图12)与动物实验的移植瘤组织检测结果一致。

4．RGS单药及联合化疗对小鼠肝肾功能的影响：

8组的单因素方差分析结果显示，8组小鼠的丙氨酸氨基转移酶(alanine transaminase, ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)、肌酐(creatinine, CREA)和肝脏重量差异均无统计学意义(均 P>0.05，表1)。

小鼠肝组织切片HE染色显示，对照组小鼠肝细胞内有少量空泡，肝细胞间隙有少量红细胞；RGS组小鼠表现与对照组类似，肝窦未见明显扩张；5－FU组小鼠肝细胞水肿，肝窦轻度扩张，肝细胞间隙可见红细胞；5－FU+RGS组小鼠肝细胞形态变化与5－FU单药组类似；OXA组小鼠红细胞进入肝周间隙，肝窦扩张；OXA+RGS组小鼠肝脏除了与单药组有相同的表现外，局部肝细胞还存在脂肪变性；IRI组和IRI+RGS组小鼠均可见肝细胞水肿，肝细胞间隙可见红细胞(图13)。

5．RGS单药及联合化疗对小鼠血常规的影响：

与对照组相比，RGS组和5－FU+RGS组小鼠的血常规各项指标无明显变化；OXA组小鼠白细胞明显减少，OXA+RGS组小鼠白细胞、血红蛋白、中性粒细胞和淋巴细胞计数也明显减少；IRI组小鼠主要出现白细胞减少，血红蛋白没有明显变化(表2)。由于取血过程中有小鼠血液标本发生凝血反应，导致5－FU组、OXA组、OXA+RGS组和IRI组部分数据缺失。

讨  论

FOLFOX方案或FOLFIRI方案(5－FU+IRI)是目前晚期结直肠癌患者最常用的化疗药物组合。基于美国国家癌症研究所监测、流行病学和结果(Surveillance, Epidemiology and End Results, SEER)数据库的分析显示，FOLFOX方案和FOLFIRI方案治疗晚期结直肠癌患者的生存获益相似。一项Ⅲ期临床试验也显示，晚期结直肠癌患者采用FOLFOX方案和FOLFIRI方案治疗的无进展生存时间分别为8.0和8.5个月，客观缓解率也相近。在FOLFOX或FOLFIRI方案的基础上联合西妥昔单抗或贝伐珠单抗等靶向药物的新型治疗策略使得晚期结直肠癌患者的平均总生存时间提高了3倍。因此，我们尝试将RGS与化疗联合以增强抗肿瘤效应。结果显示，在3种化疗药物中，仅OXA与RGS联用显著增强了疗效，而5－FU与RGS联用几乎没有抗肿瘤作用，IRI与RGS联用对小鼠肿瘤的抑制作用虽然强于RGS单药，但与IRI单药相比无明显差异。同时，我们在细胞水平验证了OXA和RGS联用的效果。RGS在DLD1和HCT116两种结直肠癌细胞系中的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC₅₀)约为10~100 nmol/L，而OXA的IC₅₀约为1~10 μmol/L，因此我们将RGS与OXA的药物联用浓度比定为1∶100。应用Compusyn软件计算两种药物在DLD1和HCT116细胞系中的CI值，以评价两种药物的协同作用。结果显示，CI值均<1，OXA和RGS存在协同作用。对小鼠肿瘤组织的Ki－67免疫组化染色和TUNEL荧光染色结果表明，RGS和OXA单药具有诱导凋亡的作用，两药联用其作用显著增强，也能显著抑制肿瘤增殖。

骨髓抑制和肝肾功能损伤等是目前晚期结直肠癌化疗药物常见的不良反应。本研究结果显示，对照组、RGS单药组、化疗单药组、化疗联合RGS组小鼠的肝肾功能指标几乎没有差异，肝脏重量相近，提示5－FU、OXA、IRI与RGS联用后并不会对小鼠肝肾功能造成明显损害。

5－FU和IRI引起的肝脏损伤主要为化疗相关性脂肪性肝炎，表现为以肝细胞脂肪变性、气球样变或脂肪性肝炎，大体观常呈黄色，发生率为20%~50%。其机制主要是线粒体功能改变导致肝细胞中活性氧累积产生氧化应激，抑制线粒体脂肪酸β－氧化而导致肝细胞出现脂肪变性。OXA化疗后可能造成肝窦阻塞综合征，其主要特征是肝脏、脾脏肿大，血小板减少会导致肝脏呈蓝色，并出现肝功能障碍。肝脏损伤也是很多药物研发过程中断的原因之一。肝脏组织切片HE染色可见，包括对照组在内的各组小鼠均有程度不等的肝细胞损伤，RGS单药组、化疗单药组、化疗联合RGS组小鼠肝细胞损伤与对照组相比差异并不明显，表明化疗药物与RGS联用后不会增强对肝脏的损伤。

对血常规的分析结果显示，RGS治疗后未出现明显的骨髓抑制。5－FU联合RGS未对血常规及肝肾功能造成明显影响。OXA单药对小鼠的白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞抑制明显，与RGS联用后会导致小鼠白细胞、血红蛋白、中性粒细胞和淋巴细胞下降。IRI单药使小鼠的白细胞数明显减少，但与RGS联用对小鼠的血常规无明显影响。

本研究中每组的小鼠数量较少，同时部分小鼠在取血过程中发生了凝血反应，进一步导致样本量减少，因此血常规部分的结果仅具有一定的参考价值

综上所述，RGS仅与OXA存在协同作用，两药联用能够显著抑制结直肠癌细胞增殖并诱导凋亡，抑制结直肠癌移植瘤的增长，骨髓抑制相应增加。